Biokemijska diagnoza bolezni jeter. Kratke informacije o strukturi jeter.

Jetra so neparni organ, ki tehta 1300-1800 g. Več kot 60% jetrnih celic so parenhimske celice - hepatociti, 25% so celice retikulohistiocitnega sistema (CSG), endotelijske ali Kupfferjeve celice, ostalo je duktalno, vezivno tkivo in druge celice.

Strukturna in funkcionalna enota jeter je jetrni akinus ali jetrna lobula, ki nastane predvsem iz hepatocitov (sl. 1). V središču jetrne lobule je jetrna vena, iz katere se izžarevajo jetrni žarki, sestavljeni predvsem iz ene vrste hepatocitov. Jetrna vena se nahaja v središču lobule, na obrobju pa je portalno polje z vejami jetrne arterije, portalne vene in najmanjše žolčne kapilare. Med žarki so razširjene kapilare - sinusi jeter. Hepatociti, ki tvorijo žarke, na eni strani, imenovani vaskularni pol, se soočajo s sinusi in invaginacije membrane sosednje strani, imenovane žolčne (žolčne) pole, tvorijo primarne žolčne kapilare (slika 2). Značilnost žolčnih kanalićul je njihova popolna izolacija od krvnih kapilarjev. Skozi membrano vaskularne polovice endocitozo in eksocitozo različnih molekul, ter žolče - sproščanje snovi iz celice. Portalska vena in jetrna arterija vstopita v jetra, ven iz žrela in žolčevod pa pride ven.

Acini je razdeljen na 3 funkcionalne cone: v 1 coni so celice, ki mejijo na portalni trakt, bolje so opremljene s kisikom in hranili. Celice 3. cone, ki se nahajajo okoli jetrne vene, so manj oskrbljene s kisikom in substrati ter bolj občutljive za ishemijo. Celice tega območja so vključene v presnovo zdravil in so tarča hepatotoksičnih zdravil.

Pri izvajanju laboratorijskih študij za pravilno diagnozo je pomembno poznati porazdelitev encimov v celici. V nadaljevanju so navedeni podatki o encimih, ki se najpogosteje uporabljajo za diagnozo.

Citoplazma vsebuje alanin aminotransferazo (ALT), del aspartat aminotransferaze (AST), laktat dehidrogenazo (LDH), del gamaglutamiltranspeptidaze (GGT) in druge encime.

V mitohondrijih (MX) večina AST (približno 70%), glutamat dehidrogenaze (GLDG), alkohol dehidrogenaze in mnogi drugi so koncentrirani.

Grobi endoplazmatski retikulum vsebuje holinesterazo (CE) itd.

V gladkem endoplazmatskem retikulumu so glukoza-6-fosfataza, UDP-glukuroniltransferaza, hem-vsebujoč membransko vezan citokrom P-450 in drugi.

Lizosomi vsebujejo kislinske hidrolaze (kisla fosfataza, ribonukleaza itd.), ki se aktivirajo z znižanjem pH celice.

Mikrovalovi žolčnikov vsebujejo membransko odvisne encime, kot so alkalna fosfataza (alkalna fosfataza), 5-nukleotidaza, del GGT, levcin aminopeptidaza (LAP).

Poznavanje arhitektonije jeter in porazdelitev encimov v celici jasno kaže na neenakomerno povečanje aktivnosti encimov v različnih patoloških procesih. S prevladujočo lezijo osrednjih delov lobul (akutni alkoholni hepatitis, akutna venska zastoj itd.) Se aktivnost mitohondrijske glutamat dehidrogenaze poveča - pomanjkanje kisika in MX-okvare ter s porazom portalnih traktov (akutni virusni hepatitis, kronični aktivni hepatitis - CAG). aktivnost citoplazmatske transaminaze.

Biokemijska diagnoza bolezni

Podatki za stik
Blago in storitve
Popravilo

Klinična biokemija, skupaj s patološko in normalno fiziologijo, je ena od treh kitov osnovne medicinske znanosti. Brez poznavanja temeljev te discipline se zdravnik ne razlikuje od učenca, ki ima idejo o boleznih le na podlagi simptomov in znakov.

Medtem klinični in biokemični kazalci, ki spremljajo spremembe v celicah na ravni molekul in kemijskih reakcij, omogočajo zanesljivo določanje vzrokov za patološka stanja telesa kot celote. Od stopnje usposobljenosti kliničnega zdravnika je odvisno, kako bo kompetentno pristopil k izbiri potrebnih biokemičnih analiz za celovit pregled pacienta in bo lahko ocenil tudi njihove diagnostične informacije, vrednost in zanesljivost.

V medicini se laboratorijske biokemijske študije pogosto uporabljajo za:

- natančna diagnoza,

- odkrivanje bolezni v predklinični fazi, t

- oceni učinkovitost predpisanega zdravljenja, t

- spremljanje stanja bolnika

- napovedovanje možnih zapletov in izidov bolezni.

Priporočeni biokemični testi

Za glavne sisteme telesa so bile razvite standardizirane raziskovalne metode, ki jih je treba izvesti brez napak z ustreznim kompleksom simptomov:

Patologija kardiovaskularnega sistema.

Angina pektoris (koagulogram, holesterol s frakcijami, aminotransferaze, trigliceridi, lipoproteinske frakcije, aterogeni indeks, laktat dehidrogenaza z izoencimi, kreatin kinaza z izoencimi);

Hipertenzija (holesterol s frakcijami, holinesteraza, sečnina, sečna kislina, kreatinin, trigliceridi, aterogeni indeks, raven elektrolitov K in Na);

Ateroskleroza (holesterol s frakcijami, lipoproteinske frakcije, trigliceridi, aterogeni indeks);

Miokardni infarkt (stresni proteini, kreatin kinaza z izoencimi, aminotransferaze, sečnina, holinesteraza, koagulogram, sečna kislina, laktat dehidrogenaza z izoencimi);

Hipotenzija (17OКС, vsebnost hidrokortizona v urinu).

Patologija sistema vezivnega tkiva.

Revmatizem (celotne beljakovine z beljakovinskimi frakcijami, glikoproteini, testi sedimentov, stresni proteini, heksoze glikoproteinov, fibrinogen, sialične kisline);

Revmatoidni artritis (protein, ki je skupen z beljakovinskimi frakcijami, glikoproteini, sialične kisline);

Protin (celotna beljakovina z beljakovinskimi frakcijami, kreatinin, urinska kislina, stresni proteini, glikoproteini);

Scleroderma (celotna beljakovina z beljakovinskimi frakcijami, fibrinogen, stresni proteini, hidroksiprolin).

Patologija žolčevodnega in prebavnega sistema.

Žolčnata bolezen (bilirubin s frakcijami, alkalna fosfataza, Y-glutamil transpeptidaza);

Atrofični gastritis (pepsinogen, gastrin);

Kronični pankreatitis (glukoza, toleranca za glukozo, skupne beljakovine z beljakovinskimi frakcijami, amilaza z izoencimi, lipaza v urinu in v krvi);

Nekroza trebušne slinavke (amilaza);

Distrofično-degenerativne spremembe v jetrih, maščobni obliki (sečnina, glutamat-dehidrogenaza, alanin-aminotransferaza, holinesteraza, aspartat-aminotransferaza);

Ciroza jeter (sečnina, holesterol, aspartat aminotransferaza, kreatinin, alanin aminotransferaza, proteinske frakcije, β lipoproteini, sedimentni vzorci);

Kronični hepatitis (iste raziskave kot pri cirozi, plus laktat dehidrogenaza z izoencimi, celotne beljakovine, alkalne fosfataze);

Hepatitis je akuten (ista raziskava kot v kronični obliki, z izjemo alkalne fosfataze in sečnine).

Patologija dihalnega sistema.

Pljučni absces, akutni bronhitis, bronhialna astma (skupna beljakovina s frakcijami, stresni protein);

Bronhiektazije (iste, plus fibrinogen);

Kronična pljučnica (skupna beljakovina s frakcijami, stresni protein, laktat dehidrogenaza z izoencimi);

Akutna pljučnica (enako kot kronična, plus glikoproteini, sedimentni vzorci, sialične kisline)

Tuberkuloza (skupna beljakovina s frakcijami, stresni protein, sialične kisline, glikoprotein, vzorci sedimentov).

Patologija urinarnega sistema.

Ledvična odpoved, akutna in kronična (skupna beljakovina s frakcijami, kreatinin, beljakovine v urinu, sečnina, vsebnost elektrolitov Na, Cl, K, Ca);

Bolezen ledvic (enako kot pri insuficienci, plus sečna kislina in elektrolit P, z izjemo Cl);

Nefrotski sindrom (enako kot pri insuficienci, plus elektrolit Mg z izjemo Cl);

Amiloidoza ledvic (enako kot pri insuficienci, plus elektrolit Mg z izjemo Cl in Y - glutamil transpeptidaze);

Kronični pielonefritis (skupna beljakovina s frakcijami, stresni proteini, alkalna fosfataza, holinesteraza, beljakovina v urinu, Y-glutamil transpeptidaza);

Glomerulonefritis (skupna beljakovina s frakcijami, stresni proteini, sečnina, Y-glutamil transpeptidaza, kreatinin, laktat dehidrogenaza z izoencimi, holinesteraza).

Patologija endokrinega sistema.

Diabetes mellitus (glukoza v urinu in v krvi, insulin, aceton, holesterol, beta-lipoproteini, z verjetnostjo skrite oblike - test občutljivosti na glukozo);

Sladkorna bolezen brez sladkorja (glukoza, vazopresin, test tolerance na glukozo);

Hipoparatiroidizem (alkalna fosfataza, vsebnost elektrolitov K in P v krvi in urinu);

Hipotiroidizem (tiroksin, trijodotironin, trigliceridi, beta-lipoproteini, holesterol, sečnina);

Gnojni tiroiditis (tiroksin, trijodotironin, stresni proteini, skupne beljakovine s frakcijami);

Avtoimunski tiroiditis (tiroksin, trijodotironin, absorpcija joda131 s ščitnico, jod, vezan na beljakovine);

Goit je endemičen (enako kot pri avtoimunski obliki tiroiditisa, plus holesterol in sečnina v urinu);

Goiter je razpršen, strupen (tiroksin, trijodotironin, TSH, vezan na beljakovine, glukoza, sečnina, holesterol).

Če zdravnik meni, da je to potrebno, so poleg glavnih dodatnih laboratorijskih testov imenovani. (Pazi na zdravljenje)

Dekodiranje biokemične analize krvi

Kaj pokaže biokemični test krvi?

Kri je eden od telesnih biomaterialov. Prisotna je v vseh organih in tkivih. Njegova sestava vključuje snovi, ki nastajajo pri delu vseh organov. Krvni test za biokemijo določa prisotnost in raven njegovih sestavin.

Če primerjamo podatke diagnostike in normalne vrednosti, lahko ugotovimo funkcionalno stanje organov, ugotovimo naravo patoloških pojavov v njih. Pri nekaterih boleznih je biokemija krvi edini način za objektivno potrditev diagnoze.

Poleg glavnih (glukoza, hemoglobin, kreatinin, holesterol in drugi) biokemijska analiza kaže tudi specifične indikatorje (elektrolite, serum, revmatoidni faktor in druge), potrebne za diagnozo endokrinoloških in genetskih bolezni. Metoda se uporablja tudi v pediatriji, športni medicini za oceno funkcionalnega stanja telesa otrok, športnikov.

Kakšne so indikacije za biokemijsko analizo krvi?

Biokemija je pogosto predpisana za bolnike ali ambulante. Za ugotavljanje ali spremljanje učinkovitosti zdravljenja se opravi krvna preiskava. Zdravnik individualno določi seznam kazalnikov, katerega raven mora biti določena pri bolniku. To je lahko en kazalnik (npr. Glukoza pri sladkorni bolezni) ali več indikatorjev (npr. Testi delovanja jeter - skupna beljakovina, bilirubin, protrombinski indeks, ALT, AST - pri hepatitisu).

Indikacije za študijo so bolezni:

hepatobilarni sistem;
ledvice;
endokrini sistem;
srca;
mišično-skeletni sistem;
obtočni sistem;
prebavil.

V kombinaciji z metodami instrumentalne diagnostike, biokemija krvi pomaga pri pravilni diagnozi v patologiji vseh notranjih organov.

Kako opraviti krvni test za biokemijo?

Biokemijska analiza preučuje vensko kri. Vzemite biomaterial iz perifernih (laktirnih ali radialnih) žil. Z omejenim dostopom do podlakti (zlomi, opekline itd.) Se iz katerekoli žile vzame kri (na rokah, nogah, nogah).

Preden opravi analizo, mora bolnik pripraviti:

8 ur pred odvzemom krvi ne moremo jesti, piti pijač, ki vsebujejo sladkor;
za 2 dni se morate vzdržati alkohola in maščobnih živil;
na predvečer študije se izogibajte fizičnemu in čustvenemu stresu.

Analiza se opravi pred zdravljenjem, pred diagnostičnimi in terapevtskimi postopki (rentgenski pregled, fizioterapija itd.).

Mesto vboda kože je obdelano z antiseptično raztopino 96% etilnega alkohola ali vodikovega peroksida. Krv v volumnu 5-10 ml se zbere v sterilno suho epruveto, ki se pošlje v študijo.

Norme biokemijske analize krvi (tabela)

Norm pri odraslih

Pri otrocih, mlajših od 14 let

Skupni bilirubin (tbil)

do 250 µmol / l (novorojenčki)

Neposredni bilirubin (idbil)

Alkalna fosfataza (alp)

Lipoproteini VP (HDL)

Do 6 g / l (med nosečnostjo)

Sečna kislina (sečna kislina)

C-reaktivni protein (crp)

Antistreptolizin O (tudi)

Kako dešifrirati biokemijsko analizo?

Dešifriranje biokemične analize krvi je primerjava dobljenih rezultatov z normativi kazalnikov. Obrazec za analizo vsebuje popoln seznam snovi, ki jih določajo biokemični laboratorij in njihove referenčne vrednosti. Včasih je dovolj, da dokončno postavimo diagnozo na podlagi odstopanja od norme enega ali več parametrov. Toda pogosteje za potrditev potrebujete rezultate dodatnih raziskav. Naslednja bo obravnavana, kar pomeni odstopanje od normativov glavnih kazalcev biokemije krvi, za katere bolezni je značilna.

Skupaj beljakovin

Skupni protein je zbirka beljakovin v krvni plazmi. Njena raven pomaga pri prepoznavanju bolezni notranjih organov in krvi. Kazalec se povečuje v pogojih:

dehidracija telesa (bruhanje, driska, opekline itd.);
akutne in kronične okužbe;
Onkološke bolezni.

Stopnja skupnih beljakovin se zmanjša z:

pomanjkanje beljakovin med postom;
bolezni jeter;
akutne in kronične krvavitve;
tirotoksikoza.

Bilirubin

Bilirubin je žolčni pigment, ki nastane zaradi uničenja rdečih krvnih celic. Presnova poteka zaradi normalnega delovanja jeter. Njena raven se spreminja glede na bolezni jeter, žolčevodov, anemijo. Bilirubin je prosta in vezana frakcija. Povečanje prvega indikatorja se zgodi, ko:

akutni virusni, strupeni, zdravilni hepatitis;
bakterijska poškodba jeter (leptospiroza, bruceloza itd.);
jetrni tumorji, primarna biliarna ciroza;
hemolitična anemija.

Povečana vsebnost vezanega bilirubina je značilna za bolezni, ki motijo pretok žolča:

žolčnih kamnov;
tumor pankreasa;
vnetne bolezni žolčevodov itd.

Encimi

Aktivnost encimov je značilna za stanje notranjih organov. Povečana zmogljivost s porazom organskih celic. Povečanje ravni aminotransferaze ALAT, ALAT se pojavi, ko:

akutni, kronični hepatitis;
jetrna nekroza;
miokardni infarkt;
poškodbe in bolezni skeletnih mišic;
holestaza;
hudo tkivno hipoksijo.

Zvišane vrednosti laktat dehidrogenaze (LDH) so značilne za:

miokardni infarkt, ledvice;
miokarditis;
obsežna hemoliza;
pljučna embolija;
akutni hepatitis.

Visoke ravni kreatin fosfokinaze (CPK) se lahko pojavijo, če: t

miokardni infarkt;
nekroza skeletnih mišic;
epilepsija;
miozitis in mišična distrofija.

Urea spada v skupino substratov - spojina z nizko molekulsko maso, ki jo sintetizirajo jetra. Raven snovi v krvi je odvisna od filtracijske sposobnosti ledvic in sintetične funkcije jeter. Razlogi za povečanje: t

bolezni ledvic (glomerulonefritis, amiloidoza, pielonefritis, zdravljenje z nefrotoksičnimi zdravili);
kardiovaskularne odpovedi;
množična izguba krvi;
opekline;
kršitev izločanja urina;
uživanje presežka beljakovin.

Razlogi za znižanje ravni sečnine: t

post in strogo vegetarijanstvo;
zastrupitev s strupi;
nosečnost;
kršitev sintetične funkcije jeter.

Sečna kislina

Končna produkt presnove nekaterih beljakovin je sečna kislina. Njegov glavni del se izloča skozi ledvice, preostanek pa z blatom. Povečanje ravni sečne kisline v krvi kaže na naslednja stanja:

odpoved ledvic;
levkemija;
limfom;
dolgotrajni post;
zloraba alkohola;
prevelikega odmerjanja salicilatov in diuretikov.

Koliko je biokemični test krvi?

Stroški biokemičnih preiskav krvi so odvisni od števila določenih parametrov. Cena vsake od njih se giblje od 130-300 rubljev. Najdražja metoda biokemičnih krvnih preiskav je imunoelektroforeza, katere stroški v nekaterih klinikah dosežejo 1000 rubljev.

Biokemija in patobiokemija jeter. Biokemijska diagnoza bolezni jeter

Biokemijska diagnoza bolezni jeter.

BIOKEMIJSKA DIAGNOSTIKA BOLEZNI ŽIVLJENJ.

Kratke informacije o strukturi jeter.

Pri izvajanju laboratorijskih študij za pravilno diagnozo je pomembno poznati porazdelitev encimov v celici. V nadaljevanju so navedeni podatki o encimih, ki se najpogosteje uporabljajo za diagnozo.

Citoplazma vsebuje alanin aminotransferazo (ALT), del aspartat aminotransferaze (AST), laktat dehidrogenazo (LDH), del gamaglutamiltranspeptidaze (GGT) in druge encime.

V mitohondrijih (MX) večina AST (približno 70%), glutamat dehidrogenaze (GLDG), alkohol dehidrogenaze in mnogi drugi so koncentrirani.

Grobi endoplazmatski retikulum vsebuje holinesterazo (CE) itd.

V gladkem endoplazmatskem retikulumu so glukoza-6-fosfataza, UDP-glukuroniltransferaza, hem-vsebujoč membransko vezan citokrom P-450 in drugi.

Lizosomi vsebujejo kislinske hidrolaze (kisla fosfataza, ribonukleaza itd.), ki se aktivirajo z znižanjem pH celice.

Mikrovalovi žolčnikov vsebujejo membransko odvisne encime, kot so alkalna fosfataza (alkalna fosfataza), 5-nukleotidaza, del GGT, levcin aminopeptidaza (LAP).

Jetra se imenuje osrednji presnovni laboratorij, ker enako učinkovito pretvarja snovi, ki izvirajo iz črevesja in presnovnih produktov, ki nastanejo v različnih organih in tkivih, kot posledica njihove življenjske dejavnosti. Trenutno je znanih več kot 500 metaboličnih funkcij. Na kratko preberite glavne.

1. Sintetično. Jetra sintetizirajo beljakovine, encime, koagulacijske faktorje, holesterol, fosfolipide itd. Glavna tvorba ketonskih teles se pojavi v jetrih.

2. Razstrupljanje za endogenega (amoniak, bilirubin itd.). in eksogena (droge itd.) snovi. Razstrupljanje zdravil vključuje dve fazi: 1 - modifikacijo zdravil pri redoks reakcijah s citokromom P 450 in konjugacijo zdravil z vodotopnimi snovmi z dodajanjem glukuroni, žveplove kisline, glutationa itd.

3. Izločanje - izločanje žolča. Naprava za izločanje žolča vključuje žolčne kanikule, mikrovile, sosednje lizosome in Golgijev kompleks. Mehanizem izločanja žolča vključuje sproščanje holesterola, žolčnih kislin, pigmentov, fosfolipidov v obliki specifičnega makromolekularnega kompleksa - žolčne micele. Primarne žolčne kisline, ki nastajajo v jetrih, vstopajo v črevo, kjer se z delovanjem črevesne flore pretvorijo v sekundarne žolčne kisline. Slednji se absorbirajo v črevesju in ponovno vstopijo v jetra (enterohepatični obtok). Jetra jih konjugirajo z glicinom in tavrinom in jih pretvorijo v amfifilne spojine z visoko sposobnostjo emulgiranja hidrofobnih. snovi. Vsi procesi, ki povzročajo kršitev razmerja sestavin v žolču (hormonsko, vnetno itd.), Vodijo do kršitve izločanja žolča - holestaze.

4. Izločanje - izločanje z žolčem različnih snovi, vključno s trdnimi snovmi.

Jetra sodelujejo pri vseh vrstah presnove.

1. Izmenjava beljakovin. Jetra sintetizirajo naslednje beljakovine:

albumin 100%, fibrinogen

₁-globulini 90%, koagulacijski faktorji krvi

₂-globulini 75% (vključno z odvisnostjo od vitamina K)

Ul-globulini 50%, psevdoholinesteraza (CE)

Albumin spada med najlažje krvne beljakovine, OMM 65-70 kD, in se sintetizira izključno v jetrih. Albumini ohranja onkotski tlak, padec njihove vsebnosti vodi do edema. Če zmanjšanje koncentracije albumina ni povezano s podhranjenostjo, s kršitvijo črevesne absorpcije ali z veliko izgubo beljakovin, je to posledica izrazitega zmanjšanja delovanja jeter. Albumini imajo pomembno vlogo pri transportu snovi, ki so slabo topne v vodi (hidrofobne). Take snovi vključujejo bilirubin, holesterol, maščobne kisline, številne hormone in zdravila. Kršitev transportne funkcije albumina vodi do številnih patoloških sprememb.

Jetra vzdržujejo raven aminokislin, vključno z aminokislinami. cikličen (tirozin, triptofan, fenilalanin), nevtralizira amoniak in ga pretvori v sečnino. Sinteza uree je ena najbolj stabilnih funkcij jeter.

2. Izmenjava lipidov. Sinteza holesterola se izvaja 90% v jetrih in črevesju. Pomemben del holesterola v jetrih se pretvori v žolčne kisline, steroidne hormone, vitamin D₂. Jetra preoblikujejo kratkocelične maščobne kisline, ki so strupene za možgane (4-8 ogljikovih atomov - kaproična, izovalerna kislina itd.) V dolgotrajne maščobne kisline (16-18 ogljikovih atomov).

3. Izmenjava ogljikovih hidratov. Jetra vzdržujejo stabilno raven glikemije z glikogenezo, glikogenolizo, glukoneogenezo. Jetra proizvajajo insulinaze - encime, ki razgrajujejo insulin, podpirajo raven mlečne in piruvične kisline.

4. Presnova pigmentov vključuje pretvorbo v hepatocite s konjugacijo z glukuronsko kislino toksičnega, maščobno topnega indirektnega bilirubina v netoksično, vodotopno neposredno. Sproščanje glukuronida v obliki dvokomponente se lahko pojavi bodisi z neposrednim izločanjem v žolčno kapilaro bodisi z vključitvijo v žolčni micel.

5. Presnova porfirina vključuje sintezo hema, ki sestoji iz kompleksa protoporfirina z železom. Heme je potrebno za sintezo jetrnih encimov, ki vsebujejo heme (citokromi itd.). Prirojena nenormalnost sinteze hema v jetrih vodi do bolezni - jetrne porfirije.

6. Izmenjava hormonov. Pri boleznih jeter opazimo povečanje ravni hormonov, ki je povezano s kršitvijo njihovega izločanja z žolčem ali izkrivljanjem normalnega presnove hormonov (nezadostno uničenje). Povečana je raven adrenalina in noradrenalina (mediatorji simpatičnega živčnega sistema), mineralokortikoid aldosteron, spolni hormoni, zlasti estrogeni, tkivni hormoni serotonin in histamin.

7. Izmenjava elementov v sledovih. Jetra sintetizirajo beljakovine za prenos (transferin) in odlaganje (feritin) železa, prav tako je glavna deponija železa. Jetra igrajo pomembno vlogo pri presnovi bakra: sintetizira ceruloplazmin, glikoprotein, ki veže do 90% bakra v krvi, in absorbira baker, ki je ohlapno vezan na albumin iz krvne plazme in izloča presežek bakra skozi lizosome z žolčo v črevo. Jetra sodelujejo pri izmenjavi drugih elementov v sledovih in elektrolitov.

Glavni sindromi pri boleznih jeter.
Pri različnih boleznih jeter so motene nekatere vrste presnove ali določene funkcije organa. Nekatere bolezni spremlja prevladujoče poškodbe jetrnih celic. drugi - primarna kršitev odtoka žolča, itd, tako da je diagnoza bolezni jeter pogosto izvaja sindrom. V nadaljevanju so opisani glavni sindromi (tabela 7).

1. Citolitični sindrom (citoliza) nastopi kot posledica motenj v strukturi jetrnih celic, povečanje prepustnosti membrane, praviloma zaradi povečanih procesov peroksidacije lipidov (LPO) in sproščanja encimov v kri. Pri citolitičnem sindromu v krvni obtok vstopajo tako citoplazmatske kot tudi mitohondrijske komponente encimov, toda citoplazemski izoencimi določajo glavno raven aktivnosti. Citoliza večinoma spremlja akutne bolezni jeter in se povečuje s poslabšanjem kroničnih bolezni. Odlikujejo se naslednji glavni mehanizmi citolize:

1) toksična citoliza (virusna, alkoholna, droga);

2) imunska citoliza, vklj. avtoimunsko;

4) hipoksično („šok v jetrih“ itd.);

5) tumorska citoliza;

6) citoliza, povezana s pomanjkanjem hrane in neustreznostjo hrane.

Citoliza ni identična s celično nekrozo: med citolizo celica ostaja živa in sposobna za različne vrste presnove, vključno s sintezo encimov, zato se lahko aktivnost encimov med citolizo poveča za več deset ali večkrat in ostane povišana za dolgo časa. Nekroza pomeni celično smrt, zato je povečanje encimske aktivnosti lahko pomembno, vendar kratkotrajno.

Najpomembnejši označevalci citolize pri akutnem hepatitisu so alanin (ALT) in aspartične (AST) transaminaze, gama-glutamil transpeptidaza (GGT), laktat dehidrogenaza (LDH).

Povečana ALT in AST opaženo pri 88-97% bolnikov, odvisno od vrste hepatitisa, več kot polovica od njih, je pomembno (10-100-krat) povečanje. Največja aktivnost je značilna za 2-3 teden bolezni, vrnitev v normalno stanje pa je 5-6 tedna. Preseganje normalizacije dejavnosti je neugoden dejavnik. Aktivnost ALT> AST, ki je povezana s porazdelitvijo AST med citoplazmo in mitohondriji. Prevladujoče povečanje AST je povezano z mitohondrijskimi poškodbami in se opazi z večjimi poškodbami jeter, zlasti z alkoholom. Aktivnost transaminaz se zmerno (2-5-krat) poveča pri kroničnih boleznih jeter, običajno v akutni fazi, in jetrnih tumorjih. Za cirozo jeter povečanje aktivnosti tranaminaz praviloma ni značilno.

Gama-glutamil transpeptidaza (GGT, GGTP, -GT) je vsebovana v citoplazmi (izoforma z nizko molekulsko maso) in je povezana z membranami žolčnega pola (izoforma z visoko molekulsko maso). Povečanje njegove aktivnosti je lahko povezano s citolizo, holestazo, zastrupitvijo z alkoholom ali drogami, rast tumorja, zato povečanje aktivnosti GGT ni specifično za določeno bolezen, ampak do neke mere univerzalno ali presejalno za bolezni jeter, čeprav vključuje dodatna iskanja vzroka bolezni.

Laktat dehidrogenaza (LDH) z mnogimi boleznimi. Diagnostična vrednost celotne aktivnosti je majhna in je omejena na opredelitev izključitve tumorskih in hemolitičnih procesov, kot tudi za diferencialno diagnozo Gilbertovega sindroma (normalno) in kronične hemolize (povečano). Za diagnozo jetrne bolezni je pomembnejša ocena jetrnega izoencima LDH - LDH₅.

Povečanje aktivnosti enega ali vseh encimov kaže na akutno bolezen jeter, poslabšanje kronične bolezni ali tumorski proces, vendar ne kaže na naravo bolezni in ne dopušča diagnoze.
2. Za holestatski sindrom (holestaza) je značilna kršitev izločanja žolča. Nekateri avtorji identificirajo redko anikterično obliko holestaze, povezano s spremembami normalnih razmerij sestavin žolča (hormonske spremembe, motnje enterohepatične cirkulacije holesterola). Odlikujejo se intrahepatična holestaza, povezana z oslabljenim izločanjem žolča s hepatociti ali žolčem v žolčnih vodih in ekstrahepatično holestazo zaradi obstrukcije žolčnih poti s kamnom, tumorjem ali dajanjem zdravil, ki povzročajo holestazo. Pri holestazi se snovi, ki se izločajo z žolčem pri zdravih ljudeh, vnesejo in se kopičijo v krvni plazmi, povečuje pa se aktivnost tako imenovanih encimov holestaze. Za tipično ikterično obliko holestaze so značilni pruritus in zlatenica.

Holestaza poveča vsebnost žolčnih kislin; bilirubin s prevladujočim povečanjem konjugiranega dela žolča (holebilirubina); holesterol in lip-lipoproteini; encimska aktivnost alkalna fosfataza, GGT, 5-nukleotidaza.

Alkalna fosfataza (alkalna fosfataza) kaže svojo aktivnost pri pH 9-10, je v jetrih, črevesju, kostnem tkivu, vendar je glavni izločilni organ jetra. Pri hepatocitih je alkalna fosfataza povezana z membranami žolčnih polov in epitelijskih mikrovilov žolčnih vodov. Vzroki za hiperfermentemijo so zapoznela izločitev encima v žolču in indukcija sinteze encimov, odvisno od bloka enterohepatičnega obtoka. Večja aktivnost pri boleznih jeter najpogosteje kaže holestazo, pri kateri se encimska aktivnost poveča za 4-10 dni do 3 ali večkrat, kot tudi jetrni tumorji. Z naraščajočo aktivnostjo alkalne fosfataze mora biti diferencialna diagnoza z boleznimi kosti.

5-nukleotidaza spada v skupino alkalnih fosfataz, se spreminja vzporedno z njimi, vendar je povečanje njegove aktivnosti povezano izključno s holestazo. Vendar pa pomanjkanje razpoložljivih komercialnih paketov ne dovoljuje uporabe tega kazalnika v celoti.

GGT Je tudi membransko vezan encim, ki se zaradi holestaze poveča zaradi aktivacije sinteze. Študija GGT s holestazo velja za obvezno.

Motnje izločanja žolča povzročajo zmanjšano emulgiranje maščob in zmanjšanje absorpcije maščobnih snovi v črevesju, vključno z vitaminom K. Zmanjšanje količine vitamina K v telesu vodi do zmanjšanja sinteze faktorjev koagulacije krvi, odvisnih od vitamina K, in zmanjšanja protrombinskega indeksa. (PTI). Pri intramuskularnem dajanju vitamina K s holestazo se PI v enem dnevu poveča za 30%.

3. Hepatodepresivni sindrom vključuje vsako disfunkcijo jeter, ki je ne spremlja encefalopatija. Sindrom se pojavlja pri mnogih boleznih jeter, vendar je najbolj izrazit pri kroničnih procesih. Za označevanje sindroma se uporabljajo stresni testi in določanje koncentracije ali aktivnosti različnih komponent seruma ali plazme.

Stres testi so občutljivi, vendar se redko uporabljajo. Te vključujejo:

a) testi na izločilni funkciji jeter - bromsulfalein, indocyanova itd.;

b) teste za razstrupljanje jeter - antipirin, kofein, hiter vzorec.

Študije so pokazale, da je sintetična funkcija najmanj stabilna pri boleznih jeter, sinteza teh snovi, ki nastajajo predvsem v jetrih, se najprej zmanjša. Na voljo so in informativni kazalci hepatodekrecije: t

1. Albumin skoraj popolnoma sintetizirane v jetrih. Zmanjšanje njegove koncentracije je opaženo pri polovici bolnikov z akutnim in 80-90% bolnikov s CAH in cirozo jeter. Hipoalbuminemija se razvija postopoma, rezultat je lahko zmanjšanje onkotičnega krvnega tlaka in edema, pa tudi zmanjšanje vezave hidrofobnih in amfifilnih spojin endogene in eksogene narave (bilirubin, proste maščobne kisline, zdravila, itd.), Ki lahko povzročijo pojav zastrupitve. Informativna vzporedna določitev albumina in celotnih beljakovin. Praviloma ostane skupna vsebnost beljakovin normalna ali se povečuje zaradi imunoglobulinov (Ig) v primerjavi z zmanjšanjem koncentracije albumina. Zmanjšanje albumina na 30 g / l ali manj kaže na kronični proces.

2 -1-Antitrypsin - glikoprotein, ki predstavlja 80-90% frakcije₁-Globulin, akutni protein, sintetiziran v jetrih, je občutljiv indikator vnetja parenhimskih celic. Izjemen diagnostični pomen, povezan s prirojenim pomanjkanjem beljakovin, ki vodi do hudih oblik poškodb jeter in drugih organov pri otrocih.

3. holinesteraza (psevdokolinesteraza, butirilholinesteraza - HE, BChE) serum, ki ga sintetizirajo jetra, se nanaša na₂-globulini. Ena od njihovih funkcij je delitev mišičnih relaksantov, ki izvirajo iz sukcinil dikolina (listenon, ditilin). Pomanjkanje encima ali pojav atipičnih oblik otežuje razgradnjo zdravil, kar otežuje proces okrevanja od anestezije. Za preprečevanje pooperativnih zapletov je priporočljivo določiti encimsko aktivnost in število dibukina, t.j. stopnjo inhibicije encima dibukaina. Pri kroničnih procesih, zlasti v cirozi jeter, se aktivnost encima zmanjša, stopnja upadanja pa ima prognostično vrednost. Drug razlog za zmanjšanje aktivnosti je zastrupitev z organofosfati.

4. Fibrinogen, I koagulacijski faktor, protein akutne faze, se nanaša na₂-globulini. Raven fibrinogena se naravno zmanjša s hudimi kroničnimi in akutnimi boleznimi jeter.

5. PTI zmanjša zaradi zmanjšane sinteze faktorjev koagulacije, odvisnih od vitamina K (II, VII, IX, X). Za razliko od holestaze se raven intramuskularne uporabe vitamina K. normalizira z intramuskularno aplikacijo vitamina K. IPT je marker resnosti akutne motnje delovanja jeter.

6. Holesterol zmanjšanje krvi pri bolnikih s kroničnim hepatitisom in cirozo jeter, pogosteje s subakutno varianto sevanja. Pri maščobnih jetrih se lahko raven holesterola poveča.

Pri kroničnih boleznih jeter v fazi kompenzacije je povečanje encimske aktivnosti neznačilno. Vendar zmerno povečanje (za faktor 1,5–3) aktivnosti transaminaz z višjo stopnjo AST kaže na poškodbo subceličnih struktur, zlasti MX.

4. Mezenhimsko-vnetni sindrom je posledica poškodbe mezenhima in strome jeter, ki je v bistvu imunski odziv na antigensko stimulacijo črevesnega izvora. Ta sindrom spremlja tako akutne kot kronične bolezni jeter. Sindromski markerji so glob-globulini, imunoglobulini, test timola, protitelesa na celične elemente itd.

Opredelitev -globulini nanaša na obvezne teste za jetra. Vzpon glob-globulinov, ki so v bistvu imunoglobulini, je značilen za večino jetrnih bolezni, vendar je najbolj izrazit pri CAG in jetrni cirozi. Nedavno je bilo dokazano, da lahko β-globuline proizvajajo Kupfferjeve celice in plazemske celice vnetnih infiltratov jeter. Pri cirozi jeter na ozadju nizke koncentracije albuminov, zaradi kršitve sintetične funkcije jeter, opazimo znatno povečanje α-globulinov, medtem ko lahko koncentracija celotnih beljakovin ostane normalna ali povišana.

Imunoglobulini (Ig) so proteini, vključeni v frakcijo glob-globulina in ki imajo lastnosti protiteles. Obstajajo 5 glavnih razredov Ig: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE, toda prve tri se uporabljajo za diagnozo. Pri kroničnih boleznih jeter se vsebnost vseh razredov Ig poveča, vendar je rast IgM najbolj izrazita. Pri alkoholnih poškodbah jeter opazimo povečanje IgA.

Test za timol - nespecifična, vendar cenovno dostopna raziskovalna metoda, katere rezultat je odvisen od vsebnosti IgM, IgG in lipoproteinov v serumu. Test je pozitiven pri 70-80% bolnikov z akutnim virusnim hepatitisom v prvih 5 dneh icteričnega obdobja, pri 70-80% bolnikov s CAH in v 60% s cirozo jeter. Vzorec je normalen pri obstruktivni zlatenici pri 95% bolnikov.

Protitelesa na tkivne in celične antigene (jedrske, gladke mišice, mitohondrijske) omogočajo identifikacijo avtoimunskih komponent pri boleznih jeter.

Dodatne raziskovalne metode vključujejo opredelitev haptoglobina, orozomukoida,₂-makroglobulin,₂-mikroglobulin, hidroksiprolin, uronske kisline.
Tabela 1.

Biokemijska diagnoza bolezni

Biokemijska diagnostika Biokemijska diagnostika (klinična kemija (biokemija), patokemija) - smer klinične laboratorijske diagnostike, katere namen je spremljanje bolnikovega stanja in diagnosticiranje bolezni z identifikacijo kemijskih komponent v biomaterialu (kri, urin, v nekaterih primerih blato, plevralni ali cerebrospinalni fluid).

Krvna plazma je organizemska tekočina, ki ima kompleksno kemično sestavo, vključno z veliko količino anorganskih ionov, encimov, hormonov, beljakovin, lipidov in ogljikovih hidratov, kakor tudi raztopljenih plinov - ogljikovega dioksida in kisika. Koncentracija vseh komponent krvi v zdravi osebi je v določenih mejah, kar odraža normalno funkcionalno stanje organizma kot celote in vsake posamezne celice posebej. V primeru različnih bolezni pride do kršitve funkcij organov in sistemov, kar vodi do neravnovesja in koncentracije ene ali več komponent krvi. Kemijska analiza krvi v procesu diagnoze temelji na tem principu. Seznam patoloških stanj, pri katerih je potrebna biokemijska analiza krvi in urina, je precej širok in vključuje bolezni srca in ožilja, endokrinih, dihalnih, izločalnih in drugih sistemov. Bolezni, ki so posledica podhranjenosti, se diagnosticirajo tudi z uporabo biokemičnih krvnih preiskav. Prebavne pomanjkljivosti se lahko odkrijejo z laboratorijskimi diagnostičnimi metodami.

Nekatere vrste tumorskih celic lahko sproščajo v krvni obtok tudi določene snovi. Vloga biokemičnih laboratorijev pri spremljanju in diagnosticiranju raka je omejena na merjenje ravni teh tumorskih označevalcev v krvi.

Varnost in učinkovitost zdravljenja z zdravili je odvisna od merjenja koncentracije zdravilnih učinkovin v krvi. In to je le en vidik ogromne vloge biokemične diagnostike pri spremljanju zdravljenja bolnikov.

Danes se večina krvnih in urinskih testov izvaja s pomočjo sodobnih visokotehnoloških avtomatiziranih diagnostičnih sistemov, katerih biokemični analizatorji omogočajo do 1000 testov v 1 uri, do 20 ali več na vsakem vzorcu. In rezultat diagnoze večine testov se dobi v 12-24 urah. Večina laboratorijev opravi določen seznam testov 24 ur na dan, saj morajo biti rezultati nujne diagnostike pripravljeni v eni uri.

TAT (ali hitrost laboratorijske diagnostike) je čas od trenutka, ko je preskus določen, do trenutka, ko je rezultat prejema, ali od trenutka, ko je bil material vzet do trenutka, ko je rezultat prejema. TAT mora ustrezati hitrosti razvoja patološkega procesa, pa tudi možnostim farmakološkega ali drugega popravka.

Nekateri bolniki v oddelkih, enotah intenzivne nege in enotah intenzivne nege pogosto potrebujejo stalno spremljanje določenih krvnih parametrov. V teh pogojih lahko medicinska sestra tega oddelka opravi določen omejen seznam preskusov s potrebno opremo, ki se nahaja v oddelku.

POGLAVJE 4 BIOKEMIJSKA DIAGNOSTIKA PATOLOŠKIH PROCESOV IN ZDRAVSTVENIH BOLEZNI

4.1. KARDIOVASKULARNA PATOLOGIJA

Na področju kardiovaskularne patologije je klinična biokemija dosegla največji uspeh pri diagnozi miokardnega infarkta. Metode klinične encimologije in imunokemije omogočajo diagnosticiranje miokardnega infarkta v prvih urah njegovega nastanka, ugotavljanje kliničnega stanja nestabilne angine, diferencialno diagnozo hude angine (ishemija) in smrti miocitov (anoksija), da se oceni učinkovitost trombolitične terapije in reperfuzijski pojav.

V skladu s priporočili Svetovne zdravstvene organizacije diagnoza infarkta miokarda temelji na tipični klinični sliki napada bolečine v prsih; EKG spremembe; povečanje krvne aktivnosti kardiospecifičnih encimov (markerjev).

Istočasno je pri ponovljenem miokardnem infarktu, kardiosklerozi in atrijski fibrilaciji ter v prisotnosti srčnega spodbujevalnika (pacemaker) pri bolniku veliko težje diagnosticirati miokardni infarkt v skladu s podatki EKG. Poleg tega več kot 25% bolnikov, pri katerih je bil na obdukciji potrjen miokardni infarkt, ni imelo sprememb EKG. Glede na prospektivno študijo, opravljeno v Združenih državah Amerike, lahko diagnozo miokardnega infarkta brez študije kardiospecifičnih markerjev smrti miocitov naredimo le v 25% primerov.

Med bolniki, ki so bili na oddelku za intenzivno nego s srčno bolečino, je le 10-15% imelo miokardni infarkt. Potrebo po diagnozi miokardnega infarkta v zgodnjih fazah narekuje dejstvo, da trombolitična terapija v prvih 2-6 urah zmanjšuje zgodnjo smrtnost v povprečju za 30%, terapija pa se začne v 7-12 urah - le za 13%. Trombolitična terapija po 13-24 urah ne zmanjša smrtnosti.

Zgodnje diagnosticiranje miokardnega infarkta vam omogoča, da uporabite in transluminalno angioplastiko, učinkovitost konzervativnega zdravljenja pa je višja, če se začne čim prej.

Prav tako je treba izvesti diferencialno diagnozo miokardnega infarkta z nestabilno angino, ko zgodnje zdravljenje lahko prepreči miokardni infarkt.

V zadnjih letih je bil arsenal biokemičnih markerjev smrti miocitov dopolnjen z novimi visoko specifičnimi testi, ki vam omogočajo diagnozo miokardnega infarkta v prvih urah njegovega pojava. To so testi, ki jih je mogoče uporabiti v prvi fazi zdravstvene oskrbe, kot tudi določitev kardiospecifičnih izoencimov in beljakovinskih označevalcev za smrt miocitov, ki se uporabljajo na oddelku za intenzivno nego v zdravstvenih ustanovah. Hkrati uspeh industrijske tehnologije in sproščanje diagnostičnih sistemov, ki temeljijo na načelu "suhe kemije", omogočata določitev specifičnih markerjev smrti miocitov v prvi fazi zdravstvene oskrbe. Tudi pod temi pogoji so diagnostične napake možne, če patofiziologija miokardnega infarkta in mehanizmi za sprejem organskih in nespecifičnih beljakovinskih znakov smrti miocitov v krvi niso jasno razumljeni.

Lokalizacija v celici pomembno vpliva na hitrost sproščanja markerja iz poškodovanega miocita. Citozolni encimi se sproščajo hitreje kot tisti, ki so strukturirani na znotrajceličnih membranah. V nasprotju s citosolnimi markerji je potrebno sproščanje znotrajceličnega kontraktalnega aparata, da se doseže intersticijski prostor strukturno povezanih proteinov, ki upočasni proces nastanka markerjev v krvi; slednji so sproščeni mitohondrijski encimi.

Pri proučevanju srčnih markerjev miokardnega infarkta je treba upoštevati številne določbe, imenovane načela diagnoze miokardnega infarkta. Ti vključujejo: 1) časovne intervale; 2) proučevanje markerjev poškodbe miokarda v dinamiki; 3) organska specifičnost laboratorijske diagnoze miokardnega infarkta; 4) kompleksna narava diagnoze; 5) koncept "sive cone".

Praktično pomembni označevalci smrti miocitov so katalitična koncentracija KK, LDH, AST, glikogen fosforilaze (GF) v krvi, povečanje vsebnosti mioglobina v krvi, miozinskih verig, troponinov Ti I. Za specifično poškodbo kardiomiocitov (ne pa tudi miocitov skeletnih mišic). koncentracije izoencimov KK-MB in LDH v krvi₁, imunokemijska določitev CK-MB in GF-BB, kot tudi razmerje izooblik CK-MB izoencima in troponinov.

Pri diagnozi miokardnega infarkta je pomembno upoštevati čas, ki je pretekel od nastopa angine. To je posledica dejstva, da precej dolgo obdobje prehaja od trenutka smrti miocitov do nastanka označevalcev v krvi. Odtok iz celic velikih beljakovinskih molekul (CC in LDH) se lahko pojavi le, če je integriteta plazemske membrane miocitov motena zaradi njihove smrti med anoksijo. Manjše molekule beljakovinskih označevalcev (mioglobin, troponin) lahko iz majhnih količin iztečejo iz celic in pod pogoji dolgotrajne hipoksije z izrazitimi spremembami v membrani miocitov pred uničenjem celic. V prvih 4 urah po okluziji koronarne arterije v območju največje ishemije je približno 60% miocitov nekrotiziranih; nekroza preostalih 40% se pojavi v naslednjih 20 urah.

Ko presežemo membrano miocitov, proteinske molekule vstopijo v zunajcelično tekočino in tečejo iz srca samo skozi limfne kanale. To določa precej dolgo časovno obdobje (3-6 ur) od časa smrti miocitov do nastanka kardiospecifičnih markerjev v krvi. Najprej se poveča vsebnost mioglobina, GF-BB in troponina v krvi, nato - KK in kardio-specifičen izoencim KK-MB, AST; bistveno kasneje poveča aktivnost LDH in srčno specifičnega izoencima LDH₁ (Sl. 4.1). Klinična občutljivost kardiospecifičnih markerjev je v veliki meri odvisna od časa, ki je potekel od smrti miocitov. Torej, za KK-MB, pri odkrivanju krvi v prvih 3-4 urah po napadu angine, je klinična občutljivost (diagnostična natančnost) le 25-45% in se poveča na 98% v območju 8-32 ur.

Sl. 4.1. Dinamika encimske aktivnosti pri miokardnem infarktu. 1 - MW-2 / MW-1; 2 - MM-3 / MM-1; 3 - KK-MB; 4 - skupno KK; 5 - LDH₁/ LDG₂

CK daje lažno negativne rezultate v 32% primerov, AST - pri 49%, mioglobin - v 15%. Aktivnost LDH je zanesljiv pokazatelj smrti miocitov po 12 urah po nastopu napada angine, vendar ostaja povišana za 10-12 dni. Podatki o aktivnosti kardiospecifičnih označevalcev v obdobju manj kot 4-6 ur po napadu angine pektoris lahko vodijo do diagnostičnih napak, kadar tudi z obsežnimi označevalci miokardnega srca smrt miocitov ni tako informativna. Poleg tega je stopnja povečanja vsebnosti srčnih markerjev v krvi v veliki meri odvisna od trajanja ishemije in časa rekanalizacije trombozirane koronarne arterije in miokardne reperfuzije po srčnem napadu.

Druga značilnost sproščanja označevalcev smrti kardiomiocitov v kri je značilna dinamika povečanja in zmanjšanja njihove koncentracije (katalitske koncentracije). To je odvisno od stalne kontrakcije miokarda, ki najprej vodi v hitro izločanje beljakovin iz nekrotiziranega dela miokarda in nato do popolnega izpiranja markerskih beljakovin v krvni obtok. Samo pri miokardnem infarktu se vsebnost markerjev smrti v kardiomiocitih v krvi poveča v razponu od 8 do 24 ur, v primeru nezapletenega miokardnega infarkta pa je podobno opazno izločanje markerskih beljakovin iz vaskularne plasti. Hkrati vsebina vsakega od markerjev »zapiše« arcuate dinamično krivuljo z različnimi časovnimi parametri. Za večino označevalcev območje krivulje daje predstavo o velikosti miokardnega infarkta, ki odraža količino nekrotičnega miokardnega tkiva. Aktivnost v krvi CC in CC-MB se poveča že s smrtjo 1 g miokardnega tkiva.

Posamezna študija AST, KK ali LDH ima relativno nizko klinično specifičnost - 66%, povečanje aktivnosti encimov ali vsebnost beljakovinskih označevalcev v 3-4 urah poveča organsko specifičnost diagnoze do 86%, tretja meritev pa vam omogoča diagnosticiranje miokardnega infarkta tudi s tako malo specifičnim testom. opredelitev AST. Dinamična študija markerjev smrti miocitov omogoča diferencialno diagnozo med miokardnim infarktom in hiperfermentemijo z masivnimi lezijami progastih mišic. V obdobju od 8 do 24 ur po napadu stenokardije je aktivnost encimov tako indikativna, da če ni dinamičnega povečanja njihove aktivnosti v krvi, potem miokardnega infarkta ni.

Absolutno specifičnih markerjev poškodbe kardiomiocitov ni bilo. Organska specifičnost pri diagnozi s pomočjo izoencimov QA temelji le na razliki v odstotnem razmerju izoencimov v posameznih organih in tkivih in posledično v krvnem serumu, ko so poškodovani.

Vrednost QC-MB. Izoencim KK-MB je specifičen za miokard, ne zato, ker ne obstaja takšen izoencim v drugih tkivih, temveč zato, ker je njegova aktivnost v kardiomiocitih 15-42% celotne aktivnosti QC, medtem ko vsebnost skeletnega mišičnega tkiva ne presega 4%, in samo v rdečih mišicah, ki se počasi spuščajo. V teh pogojih se lahko s porazom miokarda in skeletnih mišic v enaki meri poveča aktivnost CC, v odstotkih pa se aktivnost CC-MB bistveno razlikuje. Pri miokardnem infarktu vsebnost CK-MB presega 6% celotne aktivnosti CK ali 12 IU / l pri temperaturi 30 ° C.

Tako pri patologiji skeletnih mišic kot pri smrti kardiomiocitov v krvi se aktivnost KK-MB poveča, v prvem primeru pa njena aktivnost ne bo presegla 6% aktivnosti KK, v drugem primeru pa se bo povečala na 12-20%. Priporočljivo je, da se aktivnost QC-MB izrazi istočasno v enotah po 1 liter (IU / l) in kot odstotek aktivnosti QC. Določitev aktivnosti KK-MB ostaja najbolj priljubljen test pri diagnozi miokardnega infarkta. Pri miokardnem infarktu pri starejših bolnikih se lahko aktivnost QC poveča le v majhnem obsegu, vendar z znatnim povečanjem aktivnosti QC-MB. Pri takih bolnikih je diagnostično pomembno raziskati aktivnost CK-MB, tudi če se aktivnost CK ne poveča.

Med operacijami na srcu (okvare srca, operacija obvoda koronarnih arterij) se za diagnosticiranje pooperativnega miokardnega infarkta uporablja aktivnost QC-MB. Takoj po operaciji, zaradi hipoksije in poškodbe miokarda, se aktivnost KK-MB v krvi poveča in normalizira v 10-12 urah, z razvojem miokardnega infarkta pa se KK-MB aktivnost bistveno poveča in ima dinamično značilnost za miokardni infarkt.

Vrednost LDH. LDH aktivnost₁ značilnost miokarda kot tkiva z anaerobno vrsto izmenjave. V pogojih hipertrofije miokarda in kronične hipoksije sinteza LDH₁ v kardiomiocitih se začne povečevati. Pri miokardnem infarktu se poveča katalitska koncentracija LDH v krvi zaradi povečanja

vsebnost izoencimov LDH₁ in LDH₂ pri razmerju LDH₁/ LDG₂ več kot 1. LDH - citosolni encim; Znatno povečanje aktivnosti LDH v krvi pri miokardnem infarktu se pojavi pozneje kot QC in AST, v enem dnevu pa je napad angine; visoka aktivnost LDH₁ traja 12-14 dni. Kot test se uporablja zmanjšanje aktivnosti LDH v krvi na normalno, kar kaže na dokončanje obdobja resorpcije nekrotiziranega miokardnega tkiva. Če aktivnost LDH₁, določena z neposredno metodo, z zaviranjem podenote z M protitelesi nad 100 IU / l, je to zanesljiv znak miokardnega infarkta.

V nasprotju z izoencimi M podenote in LDH₃ (MMNN) LDH₄ (HMMM) in LDH₅ (MMMM) podenota H in izoencim LDH₁ (IUUH) v manjši meri LDH₂ (NННМ) lahko kot substrat uporabljajo ne samo laktat in piruvat, ampak tudi α-hidroksibutirat. To je bila podlaga za predlog za oceno dejavnosti LDH₁ v krvi z uporabo α-hidroksibutirata kot substrata; medtem ko je izozim LDH₁ imenujemo α-hidroksibutirat dehidrogenaza (α-HBDG). Pri miokardnem infarktu daje študija aktivnosti skupnega LDH in α-HBDG podobne rezultate. Če se aktivnost LDH v krvi poveča zaradi drugega patološkega procesa, bo aktivnost LDH bistveno višja kot aktivnost LDH.₁ in α-HBDG v odsotnosti dinamike, značilne za miokardni infarkt.

Pri miokardnem infarktu ni bilo pomembne korelacije med KK-MB in LDH aktivnostjo.₁ v vseh pogojih infarkta, ki se pojavi kot posledica velike razlike v dinamiki in časovnem obdobju povečanja aktivnosti teh izoencimov v krvi.

Molekule encimov, ki so vstopile v kri po smrti kardiomiocitov, so patološke komponente krvne plazme in jih je zato treba odstraniti. Glede na velikost markerskih molekul se nekatere beljakovine, na primer mioglobin, izločajo v urin ali v fagocitne celice monocitno-makrofagnega sistema. Preden se makrofagi molekule CK-MB in CK-MM fagocitirajo, se v krvi izzovejo sekvenčno delovanje proteaz, kar ima za posledico tvorbo CK-MB in CK-MM izoencimov.

Pri miocitih je izoencim KK-MM predstavljen z eno samo obliko MM-3. V krvi karboksipeptidaza zaporedno cepi končne aminokislinske ostanke lizina iz vsakega od dveh monomerov, pri čemer zaporedoma tvorita izoforme MM-2 in MM-1. Določanje KK-MM in KK-MB izooblik po metodi EF in izračun njihovega razmerja

pustite do 1 uro, da ugotovite čas smrti kardiomiocitov. Razmerje med izooblikami MM in MB se spremeni pred povečanjem aktivnosti KK-MB.

Enzimodijagnost miokardnega infarkta v klinično diagnostičnih laboratorijih je kompleksna. Najprej določimo aktivnost AST, KK in LDH, nato raziskamo aktivnost KK-MB in LDH₁. Celostni pristop k diagnostiki encimov je posledica, prvič, dejstva, da je pri proučevanju aktivnosti enega encima mogoče narediti napako; drugič, vsak od teh encimov se razlikuje v diagnostičnem pomenu in dinamiki (čas nastopa v krvi in hitrost izločanja iz vaskularne postelje). Poleg netočnosti, ki jih je mogoče izvesti pri predanalitičnem (krvnem vzorčenju za analizo) in analitičnih stopnjah, obstajajo objektivni razlogi, ki vplivajo na rezultate določanja aktivnosti encimov. Težave nastanejo, kadar se miokardni infarkt razvije v ozadju hudih somatskih bolezni, pri čemer je miokardni infarkt zapleten s kardiogenim šokom in septikemijo.

Kljub klinični specifičnosti delovanja QC pri miokardnem infarktu (98%) v nekaterih primerih povečanja aktivnosti QC in QC-MB ni mogoče ugotoviti niti v pogojih preverjanja diagnoze miokardnega infarkta po podatkih EKG. To se zgodi v primerih, ko se infarkt razvije v ozadju odpovedi ledvic in kopičenja uremičnih toksinov (srednje molekularni peptidi), pri bolnikih z jetrno cirozo in pomanjkljivo aktivnostjo razstrupljanja hepatocitov, s septikemijo in endogeno zastrupitvijo z izrazito metabolno (ali respiratorno) acidozo. V teh pogojih se tako veliko število nespecifičnih inhibitorjev kopiči v krvi, da je aktivnost QC in QC-MB praktično nedoločena. V takih primerih je aktivnost QC mogoče določiti šele po postopku, ki je v klinični biokemiji nepriljubljen v serumu, ko zmanjšanje koncentracije inhibitorjev omogoča, da se aktivnost encima pojavi.

Prisotnost inhibitorjev KK in KK-MB v krvi je spodbudila razvoj imunokemijske metode za določanje v krvi ne katalitične aktivnosti, temveč vsebnosti KK-MB po molekulski masi te oblike. To je bistveno izboljšalo občutljivost metode in ponovljivost rezultatov. Čeprav z nezapletenim miokardnim infarktom, se aktivnost KK-MB in vsebnost KK-MB beljakovin dobro ujemata, t

vsebnost QC-MB v krvi je mogoče določiti nekaj ur prej kot aktivni encim. Znatno povečanje ravni CK-MB beljakovin v krvi je bilo opaženo pri polovici bolnikov že po 3 urah, 6 ur po napadu angine pektoris pa je bila pri vseh bolnikih s klinično sliko miokardnega infarkta zabeležena visoka raven beljakovin. Že 90 minut po trombolizi se raven KK-MB beljakovin v krvi poveča večkrat. Pri bolnikih z nestabilno angino se pogosteje ugotavlja povečanje vsebnosti beljakovin CC-MB kot povečanje aktivnosti izoencima. Hkrati kljub proizvodnji diagnostičnih kompletov različnih podjetij vprašanje standardizacije metode za določanje števila QC-VM ni bilo dokončno rešeno.

Vrednost glikogen fosforilaze. Med markerji encima in izozima pri diagnozi miokardnega infarkta klinični biokemiki določajo aktivnost GF in njegovega izoencima GF-BB. GF je citosolni encim, ki katalizira odstranjevanje glukoze iz glikogena v celici.

V človeških tkivih so trije izoencimi GF: GF-LL v jetrih, GF-MM v miocitih in GF-BB v možganskem tkivu. V človeškem miokardiju obstajajo izoencimi GF-BB in GF-MM, v miocitih skeletnih mišic - samo GF-MM. GF-BB je najobčutljivejši test za diagnozo miokardnega infarkta v prvih 3-4 urah po napadu angine. Glede na diagnostično občutljivost v prvih urah lahko določitev GF aktivnosti primerjamo le z določitvijo mase KK-MB v krvi. Pri večini bolnikov se je raven GF-BB znatno povečala že po 4 urah po napadu angine in z nezapletenim miokardnim infarktom se normalizira v 48 urah.

Vrednost mioglobina. Med beljakovinskimi označevalci miokardnega infarkta je v krvi najbolj razširjena vsebnost mioglobina (MG). MG je kromoprotein, ki v citosolu vseh mišičnih celic prenaša kisik predvsem v mitohondrije. Molekularna masa MG je le 18 kD; Njegove lastnosti so podobne pri miocitih skeletnih mišic in kardiomiocitih. MG je stalno prisoten v krvni plazmi pri koncentraciji pod 80 ng / ml. Pri miokardnem infarktu se raven MG v krvi poveča za 10-20 krat.

• Povečanje MG v krvi - najzgodnejši test za diagnozo miokardnega infarkta; povečanje ravni MG v krvi je mogoče ugotoviti po 3-4 urah po napadu angine. To je prva diagnostična vrednost MG.

• Druga značilnost MG pri diagnozi miokardnega infarkta je ta, da tako majhna molekula prosto prehaja skozi filtracijsko pregrado ledvičnih teles in se hitro konča v urinu. To določa naravo sprememb v vsebnosti MG v krvi: hitro se dvigne in zmanjša prav tako hitro. Le pri določanju MG je mogoče diagnosticirati ponavljajoče se miokardne infarktne bolezni (slika 4.2), ki se razvijejo nekaj ur po prvi epizodi smrti kardiomiocitov. Poleg tega so v številnih kliničnih opazovanjih opazili pomembna nihanja ravni MG v krvi prvega dne miokardnega infarkta, ko je opazno povečanje v nekaj urah umirilo enako izrazito zmanjšanje. Situations V nekaterih primerih ostaja raven MG v krvi dolgotrajno visoka. To opažamo pri kardiogeni šok, ko zmanjšanje kontraktilne funkcije povzroči hipotenzijo, padec hidrostatskega tlaka preko ledvične membrane in prekinitev

Sl. 4.2. Dinamika koncentracije mioglobina v krvi po ponovljenem napadu angine pektoris

glomerulna filtracija, ko MG ni mogoče filtrirati v urinu. Hkrati je pozitivna korelacija med vsebnostjo MG v krvi pozitivno povezana s povečanjem ravni kreatinina.

Glavna strukturna kontraktilna enota miocitov je sarcomere, ki ga tvorijo urejene, debele in tanke vlaknine. Tanka vlakna vsebujejo aktin in kompleks troponin-tropomiozin.

Vrednost troponina. Regulacijski kompleks troponina v striatnih mišicah je sestavljen iz treh polipeptidov; Pri diagnozi miokardnega infarkta se v krvi ugotovi vsebnost samo troponina T (Tn T) in troponina I (Tn I). Vsak protein ima tri izooblike, katerih sinteza je kodirana s tremi različnimi geni. Izoformi miokarda Tn T in Tn I (srce Tn T in srce Tn I) se uporabljajo kot specifični markerji smrti kardiomiocitov.

Določanje vsebnosti Tn T omogoča diagnozo infarkta v zgodnjem in poznem obdobju. Vsebnost Tn T v krvi se po nekaj urah po napadu angine poveča. V zgodnjih fazah miokardnega infarkta je klinična občutljivost določanja mioglobina in vsebnosti KK-MB višja od Tn T, od tretjega dne pa raven Tn doseže plato, ki traja s postopnim zmanjševanjem 5-6 dni. Izkazalo se je, da je raven Tn visoka v tistih obdobjih nezapletenega miokardnega infarkta, ko se je raven aktivnosti mioglobina in KK-MB že vrnila v normalno stanje, v krvi pa ostane le visoka aktivnost LDH.₁. V nekaterih primerih se lahko pri določanju Tn T postavi diagnoza infarkta miokarda kasneje - 8-10 dni po bolečini v anginu. Še posebej je pomembno raziskati TI pri bolnikih, ki so bili sprejeti v bolnišnico 2-3 dni po napadu angine, ko se lahko indikatorji KK in KK-MB že vrnejo na prvotno normalno raven. Poleg tega se v primerjavi s KK in KK-MB vsebnost Tn T v krvi poveča, kar označuje višjo diagnostično občutljivost določanja vsebnosti Tn T v krvi.

Primerjalna študija Tn T in Tn I je pokazala večjo diagnostično občutljivost Tn I. Tako je lahko raven Tn I v krvi pri miokardnem infarktu skoraj 100-krat višja od zgornje meje normale. Pri majhnem miokardnem infarktu se raven Tn I v krvi poveča v večji meri kot aktivnost CC,

Tabela 4.1. Primerjalne značilnosti serumskih označevalcev srca

Odstotek ali razmerje QC-MB / skupaj. QC 6 Čas od nastopa bolečega napada je odvisen od metode

KK-MB in LDG₁. Določanje obeh oblik Tn T in Tn I je bolj zaželeno pri diagnozi miokardnega infarkta, ki se razvija v pooperativnem obdobju in po ukrepih aktivne reanimacije.

Ni idealnega označevalca stanja kardiomiocitov (tabela 4.1). Pri diagnozi miokardnega infarkta klinični biokemiki običajno uporabljajo najbolj organsko specifične izoenzime in identificirajo proteinske markerje, ki vsebujejo samo miokardne celice. Vendar pa se za diagnozo miokardnega infarkta v laboratorijih še naprej ugotavlja in MG. Vendar pa se z nezapletenim miokardnim infarktom dinamika nespecifične MG v krvi praktično ponovi, kot pri kardio-specifičnih CC-MB, ki je 4-6 ur pred njim, obenem pa poskusi določanja vsebnosti MG v urinu za diagnozo miokardnega infarkta niso bili uspešni.

4.2. BOLEZNI ŽIVLJENJA

Kljub številnim biokemičnim procesom, ki se pojavljajo v jetrnih celicah, nimajo vse diagnostične vrednosti. Razlog za to so omejene metodološke zmožnosti laboratorija, nizka raven znanja o patofiziologiji jeter ter enosmerne spremembe v številnih biokemičnih testih.

Prevladujoča vrednost laboratorijske diagnostike jetrne bolezni je določanje encimske aktivnosti. Encime, ki jih sintetizirajo hepatociti in epitelne celice žolčnih vodov, lahko razdelimo na indikatorske, sekrecijske in izločajoče. Izločevalni encimi vključujejo holesterazo, njena aktivnost v krvi pri boleznih jeter se zmanjša zaradi kršitve njene sinteze. Z izločevalnimi encimi so alkalna fosfataza, GGT in PAWS. Največja skupina diagnostično pomembnih encimov so indikatorski encimi, vključno z ALT, AST, LDH in GLDH. V zavihku. 4.2 kažejo navedene encime in njihovo znotrajcelično porazdelitev.

Razširjena v diferencialni diagnozi jetrne bolezni je prejela metodo primerjave stopnje povečanja aktivnosti encimov z različno lokalizacijo v hepatocitih in odraža različne strani funkcionalne aktivnosti celičnih lezij. Najbolj uporabljeno razmerje encimov je predstavljeno v tabeli. 4.3.

Tabela 4.2. Jetrni encimi

Tabela 4.3. Razmerje jetrnih encimov

Pri boleznih jeter uporabite koeficient De Ritis (razmerje AST / ALT). Razmerje AST / ALT več kot 2 je značilno za lezije, ki jih povzroča alkohol, in manj kot 1 za virusni hepatitis in holestatski sindrom. V večini primerov virusnega hepatitisa je razmerje AST / ALT ostalo pod 1. Pri virusnem hepatitisu se aktivnost ALT poveča za desetkrat. Pri akutnem alkoholnem hepatitisu je aktivnost AST višja od ALT, medtem ko aktivnost obeh encimov ne presega 500-600 IU / L. Bolniki s toksičnim hepatitisom, infekciozno mononukleozo, intrahepatično holestazo, cirozo, jetrnimi metastazami, aktivnostjo AST pri miokardnem infarktu je višja od aktivnosti ALT. Aktivnost ALT in AST se poveča pri jemanju eritromicina, para-aminosalicilne kisline, diabetične ketoacidoze, psoriaze, uporablja se tudi za zgodnjo diagnozo anikternega hepatitisa.

V diferencialni diagnozi jetrne patologije je pomembno raziskati razmerja aktivnosti izoencimov LDH. Povečanje relativne aktivnosti izoencima LDH₅ značilne za lezije hepatocitov. LDH hiperfermentemijo opazimo v različnem obsegu pri akutnem virusnem, zdravilnem in hipoksičnem hepatitisu, srčnem popuščanju, cirozi jeter in ekstrahepatični holestazi ter zmanjšanju osmotske odpornosti eritrocitov in hemolize. Dolgoročno povečanje aktivnosti izoencimov LDH₅ in LDH₄ kaže na prisotnost jetrnih metastaz.

Trenutno je pri diagnozi bolezni jeter stabilnost koloidnih sistemov še vedno ocenjena s timolom in sublimatskimi testi. Patološki rezultati odražajo zgodnja obdobja akutnega hepatitisa, toksične poškodbe jeter, poslabšanje kroničnega hepatitisa. ESP proteini v krvnem serumu prav tako zagotavljajo nespecifične podatke, vendar omogoča presojo narave patološkega procesa. Odstotek albuminov, akutnih faznih proteinov in γ-globulinov pomaga pri diagnozi jetrne patologije: za cirozo jeter je značilen nizek albumin in visoka raven γ-globulinov. Povečane koncentracije γ-globulinov v krvi so tudi v maščobni infiltraciji jeter, vnetju žolčnih vodov in malignosti.

Vsebnost albumina v serumu ima diagnostično vrednost pri akutnih in kroničnih oblikah hepatitisa. V vseh primerih akutnega hepatitisa ostaja raven albumina v krvi normalna.

Kronični hepatitis spremljajo hipoalbuminemija in hipergamaglobulinemija.

Jetra so osrednji člen pri uravnavanju strjevanja krvi. Hepatociti sintetizirajo fibrinogen, veliko aktivatorjev in inhibitorjev kaskadnih encimskih reakcij. Akutni in kronični hepatitis motijo to ureditev. Diagnostični testi za bolezen jeter vključujejo podaljšanje protrombinskega časa, kopičenje v krvi produktov uničenja fibrinogena. Akutno poškodbo jeter spremlja povečana krvavitev v pogojih hipofibrinogenemije.

Okvarjeno delovanje jeter spremlja sprememba v presnovi LP. Hipertrigliceridemija je značilna za različne oblike patologije jeter. Hiperholesterolemija se pogosto pojavi, ko so žolčevodi blokirani in obstruktivna zlatenica. Pri kroničnem hepatitisu se prosti holesterol kopiči v krvi zaradi zmanjšanja njegove esterifikacije v krvnem obtoku. V pogojih izrazite holestaze opazimo nastanek holestatske makroskopske oblike LP-LP-X, ki tvori kompleks LP s fragmentom plazemske membrane.

V večini primerov bolezni jeter etiološki dejavnik ostaja izven diagnoze in klinični biokemiki oblikujejo diagnozo, ki temelji na načelih sindromske diagnoze.

Glavni patološki procesi, ki tvorijo laboratorijsko diagnozo bolezni, so naslednji sindromi:

• intrahepatična in ekstrahepatična holestaza;

• strupene lezije hepatocitov;

• pomanjkanje sintetičnih procesov v hepatocitih;

• upočasnitev inaktivacije strupenih spojin;

Citolizni sindrom. Patofiziološka osnova sindroma citolize je kršitev celovitosti plazemske membrane hepatocitov in njihovih organelov z razvojem hiperfermentemije. Huda hiperfermentemija pri vstopu citosolnih encimov v krvni obtok je značilna za infekcijski hepatitis, zdravilno in toksično poškodbo jeter, zastrupitev, dekompenzirano cirozo in perifokalno vnetje parenhima pri holangitisu. V encimodijagnozi citoliznega sindroma prevladuje definicija

Aktivnosti ALT, AST in LDH. Običajno aktivnost ALT in AST v krvi ne presega 24 IU / l; v 100 IU / L se hiperfermentemija šteje za „sivo območje“, ki je lahko posledica reaktivnih sprememb v hepatocitih. Aktivnost ALT nad 100 ie / l kaže na poškodbo jetrnega parenhima. Povečanje aktivnosti ALT v 100-200 krat (do 2-6 tisoč ie / l) odraža obsežno poškodbo hepatocitov pri virusnem hepatitisu in zastrupitvi z organskimi topili.

Sindrom intrahepatične in ekstrahepatične holestaze. Intrahepatični holestazni sindrom določa kršitev iztoka žolča iz jeter. Povečanje volumna hepatocitov povzroči kompresijo žolčnih vodov, oslabljeno funkcijo drenaže. Obturacija velikih žolčnih vodov je vzrok za ekstrahepatično holestazo; najbolj izrazita holestaza z obstruktivno zlatenico. V zavihku. 4.4 prikazuje kombinacijo laboratorijskih testov, ki se najpogosteje uporabljajo za diferencialno diagnozo holestaze.

Tabela 4.4. Diagnoza holestaze

Zanesljivi označevalci intrahepatičnega sindroma holestaze so povečanje aktivnosti ALP, GGT in 5-nukleotidaze v krvi. V epitelni membrani žolčevoda se encimi nahajajo blizu drug drugemu, zato se z uničenjem membrane njihova aktivnost v krvnem obtoku povečuje istočasno in enakomerno.

Na podlagi aktivnosti alkalne fosfataze ocenimo reaktivne spremembe v epitelu žolčevodov in plazemskih membran hepatocitov. Aktivnost alkalne fosfataze pomaga pri diferencialni diagnozi intrahepatične in ekstrahepatične holestaze. Med ekstrahepatično obstrukcijo (kamni žolčnih kanalov, neoplazma papile Vater) se aktivnost alkalnega fosforja poveča 10-krat ali več. Intrahepatično obstrukcijo v parenhimskih lezijah (hepatitis) spremlja

je povečanje aktivnosti alkalne fosfataze za 2-3 krat. Akutne nekroze hepatocitov ne sme spremljati povečanje aktivnosti alkalne fosfataze, če to ne povzroči kompresije žolčnih vodov (intrahepatična holestaza). Pri vseh patoloških procesih v jetrih ni opaziti odvisnosti med aktivnostjo alkalne fosfataze in hiperbilirubinemije. V zgodnjih fazah intrahepatične holestaze je povečanje aktivnosti alkalne fosfataze posledica aktivacije njegove sinteze; nadaljnje povečanje je povezano z uničenjem žolčnih kanalikulov pod vplivom žolčnih kislin.

Sindrom intracelularne holestaze. Povečanje velikosti hepatocitov in njihovo stiskanje žolčnih vodov med segmenti jeter povzroči nastanek intracelularnega sindroma holestaze z zmernim povečanjem aktivnosti alkalne fosfataze in GGT v krvi ter poškodbo epitelija žolčnih vodov. Zvišanje vsebnosti žolčnih kislin v krvi je tudi zgodnji simptom holestaze.

Najpogostejši simptom jetrne bolezni, ki jo spremlja holestaza, je kopičenje bilirubina v krvi. Resnost hiperbilirubinemije je nezanesljiva za diferencialno diagnozo intrahepatične in ekstrahepatične holestaze. Hkrati ima hiperbilirubinemija prognostično vrednost. Povečanje ravni bilirubina je petkrat značilno za intrahepatično holestazo, povečanje koncentracije bilirubina je 10-krat bolj značilno za akutni hepatitis.

Sindrom strupenih poškodb hepatocitov se razvije, na primer, med alkoholno zastrupitvijo, kadar učinki citolize niso prisotni, vendar alkohol krši funkcijo mitohondrijev.

Pri akutni zastrupitvi z alkoholom se razvije sindrom strupenih poškodb subceličnih formacij in celovitost plazemskih membran v hepatocitih ni ogrožena. Alkoholni metaboliti imajo toksičen učinek, zlasti acetaldehid, ki se tvori neposredno v mitohondrijih. Istočasno je v celici poškodovana tvorba visokoenergijskih spojin, zlasti ATP, kar ima patološki učinek na procese razstrupljanja strupenih spojin. V akutnem obdobju alkoholnega hepatitisa lahko aktivnost AST prevladuje v krvi zaradi visoke aktivnosti mitohondrijskega izoencima AST in ne citoplazme.

Vkljucitev hepatocitov v patološki proces mitohondrije spremlja pojav glDG aktivnosti v krvi. Povečana aktivnost GlDG je zgodnji test alkoholnega hepatitisa, vendar je za obstruktivno zlatenico značilno 8-10-kratno povečanje aktivnosti GlDG z zmerno aktivacijo AST in ALT. Za strupene snovi

učinke alkohola zaznamuje izrazito povečanje krvne aktivnosti GGT brez znatnega povečanja aktivnosti alkalne fosfataze.

Sindrom pomanjkanja sintetičnih procesov se kaže v zmanjšanju sinteze hepatocitnih transportnih proteinov, beljakovin koagulacijskega sistema krvi, CE.

HE in njegovi izoencimi sintetizirajo hepatocite. V razmerah parenhimske lezije se zmanjša sinteza ChE in njegova aktivnost v krvi. Pogosteje se zniža krvni CE kot posledica toksičnih učinkov (citostatiki, insekticidi, fungicidi, fluoridi). Fiziološki upad aktivnosti ChE se pojavi med nosečnostjo. Opaženi so redki primeri genetsko določenega zmanjšanja sinteze ChE.

Pri akutni odpovedi jeter se pri vsaki četrti bolnici pojavi hipoglikemija. V pogojih kopičenja vmesnih metabolitov in razvoja insulinske rezistence je možen tudi pojav hiperglikemije. Pri dolgotrajni odpovedi jeter se pojavi hiperinzulinemija (zmanjšanje uničenja hormona v jetrih). V pogojih hipoksije in aktivacije anaerobne glikolize nastane presnovna acidoza s kopičenjem mlečne kisline v krvi (laktatna acidoza). Metabolna acidoza povzroča kršitev razmerja elektrolitov. Poraz jetrnega parenhima spremlja zmanjšanje tvorbe kreatinina in sečnine. K temu nedvomno prispevajo neustrezen vnos beljakovin in prebavne motnje. Vendar je glavni vzrok hipokreininemije zmanjšanje sinteze kreatinina v hepatocitih. Pri bolnikih s hepatitisom je hipokreininemija povezana z zmanjšanjem ravni sečne kisline v krvi.

Sindrom upočasnjevanja inaktivacije strupenih spojin je posledica inhibicije njihove hidroksilacije v mikrosomskem aparatu hepatocitov, kar zmanjšuje hitrost inaktivacije mnogih zdravil v telesu. V teh razmerah lahko celo nizek terapevtski odmerek zdravila povzroči izrazit stranski učinek.

Jetra služijo kot biološka pregrada endogenih in eksogenih strupenih spojin, ki v glavnem prihajajo iz prebavil. Ocena detoksikacijske funkcije jeter se pogosteje izvaja s kroničnimi lezijami z uporabo stresnih testov z galaktozo, fenoletrabromoftalen sulfonsko kislino, bromocianovimi zelenimi, označenimi spojinami. Testi obremenitve omogočajo diagnosticiranje kroničnih oblik bolezni, da se ocenijo

rezidualni učinki prenesenega hepatitisa, da tvorijo idejo o funkciji jeter pri cirozi, maščobni infiltraciji jeter.

V hudih primerih jetrne kome z akutnim virusnim hepatitisom ali portalno hipertenzijo se oceni detoksifikacijska funkcija jeter glede na količino amoniaka v krvi. Nastajanje amoniaka v črevesju poteka nenehno kot posledica vitalne aktivnosti mikroorganizmov in deaminacije aminokislin, ki nastanejo iz prehranskih beljakovin. Med množičnimi krvavitvami iz želodca ali žil na požiralniku obstaja povečana tvorba amoniaka iz krvnega albumina.

Vnetni sindrom je posledica aktivacije celic RES. Zanj je značilno povečanje vsebnosti beljakovin v akutni fazi, disproteinemija v nasprotju z razmerjem serumskih beljakovin na elektroforegramu, sprememba vzorcev sedimenta (timol), povečanje koncentracije imunoglobulinov.

Kljub raznolikosti teh motenj je uporaba tehnik diagnostike sindromov učinkovita že v zgodnjih fazah jetrne bolezni. Seveda rezultati biokemijskih študij v diagnostičnem procesu niso edinstveni. Hkrati zdravniki uporabljajo podatke iz anamneze in fizičnega pregleda, rezultate radionuklidne diagnostike, računalniške tomografije in biopsije jeter. Hkrati se lahko diferencialna diagnostika v zgodnjih fazah bolezni in ocena narave poškodb hepatocitov izvede le na podlagi laboratorijskih testov, predvsem podatkov iz klinične biokemije. Uporabljene kombinacije laboratorijskih študij so predstavljene v tabeli. 4.5.

Tabela 4.5. Diagnoza jetrnih bolezni z encimi

4.3. PATOLOGIJA KOVINSKE TKIVINE

Glavni dejavniki, ki uravnavajo presnovo fosfata in kalcija, so PTH, kalcitonin in vitamin D. PTH in kalcitonin vzdržujeta stalnost kalcija v žilni postelji in zunajcelični tekočini, vplivata na absorpcijo kalcija v črevesju, reabsorpcijo v ledvicah, črevesju in odlaganje v kostnem tkivu. PTH uravnava kalcij v krvi, kar vpliva na absorpcijo kalcija v črevesju in ledvičnih tubulih, mobilizacijo kalcija iz kostnega tkiva. Kalcitonin ima manj pomemben učinek, saj zmanjšuje aktivnost osteoklastov, povečuje aktivnost osteoblastov, kar vodi do zmanjšanja kalcija v krvi.

PTH je polipeptid, katerega edina veriga je sestavljena iz 84 aminokislinskih ostankov. Hormon izloča paratiroidne žleze, verjetno v obliki neaktivnega prekurzorja, iz katerega tvorimo aktivni hormon s cepitvijo fragmenta polipeptida. Aktivni PTH ima kratko razpolovno dobo, kar povzroča težave pri analizi: z metodo radioimunskega testa se večinoma meri karboksi-terminalni fragment hormona, ki ima daljši razpolovni čas, vendar je biološko neaktiven.

Pri delovanju na ledvice PTH zavira reabsorpcijo fosforja v proksimalnih in distalnih tubulih nefrona, povečuje njegovo izločanje in s tem znižuje raven fosforja v krvi (hipofosfatemija). Hkrati pa hormon poveča tubularno reabsorpcijo kalcija, zlasti v distalnih tubulih nefrona. Delovanje PTH v kostnem tkivu povzroči mobilizacijo kalcija in fosfata, kar prispeva k pojavu osteoporoze in hiperkalcemije. Negativna povratna hipokalcemija je glavna spodbuda za izločanje PTH, medtem ko hiperkalciemija zavira nastanek hormona s paratiroidnimi žlezami. PTH prav tako poveča absorpcijo kalcija in fosforja v črevesju, kar spodbuja sintezo 1,25-dihidroksikolekalciferola.

V primerih hipersekrecije PTH s paratiroidnim adenomom se razvije izrazita osteoporoza ob prisotnosti

hiperkalcemija in hipofosfatemija ter povečano izločanje kalcija in fosfata v urinu. V teh pogojih se reabsorpcija fosfatov v tubulih zavira in posledično se poveča izločanje fosfatov, povečuje se očistek fosfatov s pojavom hiperkalcemije v pogojih resorpcije kosti z razvojem osteoporoze. Diagnozo lahko potrdite z določitvijo koncentracije PTH v krvi. V primerih, ko hipofosfatemijo spremlja hiperkalciemija, je diagnostično pomembno tudi zmerno povečanje vsebnosti hormona.

Upoštevati je treba, da se v nekaterih oblikah tumorjev pljuč, ledvic, jajčnikov v tumorskih celicah pojavi ektopična tvorba PTH. Med takšnimi stanji je treba razlikovati med obliko rahitisa, odpornega na vitamin D. Ta redko pojavljajoča se dedna bolezen, povezana s spolom, se imenuje Fanconijev sindrom. Za slednje je značilno visoko izločanje fosforja v urinu hkrati z glukozurijo in aminoacidurijo brez pojava acidoze v krvi.

Pri kronični odpovedi ledvic se lahko kot kompenzacijski mehanizem v razvoju hipokalcemije in hiperfosfatemije pojavi aktivacija sinteze PTH. Sekundarni hiperparatiroidizem je opažen tudi pri osteomalaciji, ki jo povzroča znatno zmanjšanje absorpcije kalcija v črevesju s povečanim izločanjem.

To patološko stanje se najpogosteje pojavi kot zaplet operacije na ščitnici, ko se obščitnične žleze po pomoti odstranijo. V tem primeru je raven kalcija v krvi tako nizka, da se razvijejo specifični simptomi hipokalcemije in hiperfosfatemije (simptomi Khvostek in Trusso), izločanje kalcija in fosforja z urinom se zmanjša. To stanje zahteva takojšnjo intravensko dajanje kalcijevega klorida.

V klinični sliki psevdo-hipopatiroidizma je sprememba koncentracije fosfata in kalcija v krvi podobna kot pri primarnem hipoparatiroidizmu, hkrati pa se poveča vsebnost PTH v krvi. To stanje

značilno za genetsko bolezen (Albrightova bolezen), povezano z nezmožnostjo tubularnih celic ledvic, da se odzovejo na hormon.

Drugi hormon, ki uravnava presnovo fosforja in kalcija, je kalcitonin. Eno verižni peptid z 32 aminokislinskimi ostanki izloča parafolikularne celice stranskih reženj ščitnice. Ta hormon zavira mobilizacijo fosfata in kalcija, medtem ko se njihova vsebnost v krvi zmanjšuje (hipokalcemija in hipofosfatemija). Učinek hormona na ledvice ni dobro razumljen; Kalcitonin naj bi povečal tubularno izločanje fosfatov. Poleg tega hormon zavira stimulacijski učinek PTH na sintezo 1,25-dihidroksihaloalkalciferola.

VLOGA VITAMINA D

Tretji dejavnik, ki dejavno vpliva na presnovo kalcija in fosforja v kostnem tkivu, je vitamin D. Sinteza vitamina D v telesu poteka v dveh fazah hidroksilacije: prva se pojavi v jetrih, da tvori snov z omejeno biološko aktivnostjo; druga stopnja se pojavi v ledvicah z nastajanjem vitamina D₃, holekalciferola z največjo biološko aktivnostjo. Vitamin D v tankem črevesu₃ stimulira absorpcijo fosforja in kalcija, v proksimalnih delih cevastega dela nefrona aktivira reabsorpcijo obeh ionov. Dejavniki, ki aktivirajo sintezo vitamina D₃ v ledvicah je zmanjšanje vsebnosti fosforja v krvi in učinek PTH.

V pogojih pomanjkanja vitamina D zaradi zmanjšanja vsebnosti maščobnih topnih sestavin v hrani, nezadostnega ultravijoličnega obsevanja kože ali malabsorpcije je v krvi opažena izrazita hipofosfatemija. Kot odziv na povečanje izločanja PTH, se absorpcija kalcija in fosfata v tankem črevesu in mobilizacija mineralov iz kostnega tkiva povečata. V določenem časovnem obdobju to normalizira vsebnost kalcija v krvi, vendar lahko koncentracija fosforja ostane zmanjšana zaradi zaviranja reabsorpcije paratiroidnega hormona.

Pri kronični odpovedi ledvic se razvije sindrom ledvične osteodistrofije - kompleksna kršitev presnove kostnega tkiva in fosforno-kalcijeve homeostaze. Zmanjšanje v glomerulah

filtracija povzroči hiperfosfatemijo, hipokalcemija se razvije z zmanjšanjem sinteze vitamina D v ledvicah in odpornostjo na njegove učinke. Hiperfosfatemija lahko prispeva k razvoju hipokalcemije zaradi zmanjšanja absorpcije kalcija v tankem črevesu zaradi nastajanja netopnih apatitov.

METABOLIČNE BOLEZNI TKIVA

Presnovne bolezni kosti se delijo na osteoporozo, osteomalacijo, osteodistrofijo, osteogenezo imperfekto in osteoporozo. Bolezni kosti se lahko razvijejo tudi v ozadju druge patologije, kot je akromegalija ali ektopična kalcifikacija v žilni steni (z aterosklerozo in normalno z nastankom "možganskega peska" v epifizi).

Osteoporoza je najpogostejša presnovna bolezen kosti. Osteoporoza je značilna za številne bolezni, za katere je značilna splošna izguba kostnega tkiva, ki presega starostne in spolne standarde in vodi v zmanjšanje trdnosti kosti, kar povzroča občutljivost na zlom (spontano ali z minimalno poškodbo). Osteoporozo je treba razlikovati od osteopenije (starostne atrofije kostnega tkiva) in osteomalacije (oslabljena mineralizacija kostnega matriksa).

Med dejavniki tveganja za osteoporozo spadajo pripadnost kavkazi ali mongoloidni rasi, družinska nagnjenost, telesna masa manj kot 58 kg, kajenje in alkoholizem, nizka ali prekomerna telesna dejavnost, zgodnja menopavza, pozni nastop menstruacije, amenoreja in neplodnost, podaljšana dojenje (več kot 6 mesecev). več kot tri nosečnosti in poroda v rodni dobi ter zloraba kave (več kot pet skodelic na dan), pomanjkanje vnosa kalcija iz hrane in podaljšano parenteralno prehrano.

Klinična slika se v večini primerov razvija postopoma, običajno več let. Pri laboratorijski diagnostiki je pomembno določiti raven alkalne fosfataze (ki se lahko po prelomih povečuje), kalcija in fosfata (običajno normalnih). Aktivnost kostne resorpcije je določena z razmerjem med kalcijem v urinu in kreatininom v urinu ter razmerjem med vsebnostjo hidroksiprolina v urinu in kreatininom v urinu. Z rentgenskim pregledom hrbtenice se pokaže zmanjšanje gostote kosti s poudarjanjem

kortikalne konture. Videz radiografije takšnih odstopanj je možen le z izgubo vsaj 30% kostnega tkiva.

Osteomalacija je skeletna patologija, ki se pojavi, ko organska matrica kosti nima mineralizacije. Pri otrocih so rahitis (glejte spodaj), pri odraslih, presnovne motnje kalcija, fosforja in vitamina D. t

Rahitis - bolezen zgodnjega otroštva, ki je posledica pomanjkanja vitamina D, za katero so značilne spremembe v kostnem tkivu z razvojem okostja. Vse patofiziološke procese povzroča hipokalcemija, ki je posledica pomanjkanja vitamina D in njenih presnovkov. Nastopi kompenzacijska aktivacija paratiroidnih žlez in hiperprodukcija PTH, ki mobilizira izločanje kalcija iz kosti in poveča absorpcijo kalcijevih in fosfatnih soli v črevesju. Pojavijo se hipofosfatemija, presnovna acidoza in osteogeneza.

Deformirajoča osteodistrofija (deformacija osteitisa, Pagetova bolezen) je dedna bolezen, za katero so značilne deformacije femoralne in tibialne kosti, hrbtenice in lobanje s hudo hiperostozo, zadebljanjem in ukrivljenostjo kosti, povečano pojavnostjo tumorjev. Ponavadi se pojavi v starosti 50 let. Klinična slika je ponavadi asimptomatska, najpogostejša manifestacija je bolečina v kosti ali sklepu. Redkeje so opažene deformitete kosti, glavobol, patološki zlomi, povišanje telesne temperature preko prizadete okončine, srčno popuščanje z visokim srčnim pretokom in različne nevrološke motnje zaradi kompresije živčnega tkiva (s poškodbami lobanje, najpogosteje gluhimi). Laboratorijska značilnost je povečanje alkalnega fosforja in osteokalcina v osteosklerotični fazi, povečanje ravni hidroksiprolina v osteolitični fazi. Serumski kalcij in fosfor sta običajno normalna.

Ledvična ali uremična osteodistrofija je pogosta poškodba kosti, podobno osteomalaciji, rahitisu ali fibroznemu ostitisu; pri kronični odpovedi ledvic.

Albrightova dedna osteodistrofija je posledica odpornosti ciljnih celic na delovanje PTH (psevdohipoparatroidizem). Bolniki s psevdohipoparatiroidizmom so odporni na druge hormone, ki delujejo prek sistema adenilat ciklaze.

(ščitnični hormon, glukagon, FSH, LH). Pri teh bolnikih opazimo značilen fenotip, ki se kaže v brahidaktiliji, kratki rasti, podkožni okostenitvi. Albrightova bolezen se pogosto kombinira s sladkorno boleznijo, arterijsko hipertenzijo, debelostjo, menstrualnimi motnjami (oligomenoreja), arteritisom, poliartrozo. Prav tako je značilna duševna zaostalost in konvulzije (zaradi hipokalcemije).

Nepopolna osteosinteza je dedna bolezen, ki povzroča zmanjšanje kostne mase (zaradi kršitve osteogeneze) in povzroči njihovo povečano krhkost; pogosto spremlja modra sprememba barve bele kože, anomalije zob (nepopolna dentinogeneza) in progresivna izguba sluha. Ultrazvok razkriva hude oblike ploda od 16. tedna nosečnosti. Diagnoza je mogoča z uporabo DNA študij v vzorcih biopsije horionskih vilic. Simptomatsko in ortopedsko zdravljenje.

Osteoporoza in osteoskleroza sta kolektivna in v praksi identični koncepti, ki označujejo relativno povečanje vsebnosti kostnega tkiva v kostih, kar vodi do zmanjšanja volumna kostnega mozga z neizogibno okvaro hemopoeze.

Marmorna bolezen. Znanih je več podedovanih oblik: prevladujoča podedovana Albers-Schoenbergova bolezen in recesivne oblike so maligni, benigni in smrtonosni. Pogostnost vseh oblik - približno 1: 20.000 Klinično osteopetroza te patologije kaže več zlomov, osteomielitis, hiperostoza lobanje, kroničnega rinitisa zaradi zoženja nosne votline, hepatosplenomegalija (s kompenzacijskim ekstramedularne hematopoeze povzročenih), ohromelost obraznega živca, anemija (z zmanjšanjem povzročene obsega kostnega mozga) in laboratorij - s povečanjem ravni alkalne fosfataze.

4.4. OZNAČEVALCI RAZLIČNE RASTI

Nobenega dvoma ni, da je uspeh zdravljenja raka mogoče pričakovati le, če se v zgodnji fazi razvoja odkrijejo maligni tumorji, vendar vprašanje pravočasnega odkrivanja znakov takšnih patologij še vedno ostaja odprto.

V zadnjih letih so se diagnostične zmožnosti kliničnih onkologov močno razširile v povezavi z uporabo sodobnih instrumentalnih diagnostičnih metod: angiopatija in limfografija, radionuklidna diagnostika, računalniška oprema

toplotne in rentgenske tomografi, radio-magnetna resonanca, ultrazvok z Dopplerjevim učinkom, ki omogočajo barvno sliko tumorja in ocenijo značilnosti mikrocirkulacije. Sodobne imunomorfološke in citološke študije omogočajo preučevanje vzorcev biopsije ne samo samega tumorja, temveč tudi različnih izločkov (sputum, urin, ascitna tekočina). Trenutno kompleksna laboratorijska biokemijska in imunološka diagnostika temelji na identifikaciji tumorskih markerjev, hormonov, biološko aktivnih spojin, encimskih izooblik in presnovkov kosti v primeru metastatskih kostnih lezij.

Začetek študije tumorskih markerjev je bil zelo spodbuden. Že konec 19. stoletja so v urinu bolnikov z multiplim mielomom našli specifične beljakovine (imunoglobuline), ki so jih imenovali Bens-Jonesove beljakovine, naslednji uspeh pa je moral čakati več kot 80 let. Povezano je z odkritjem geografske označbe. Abelev in Yu.S. Tatarin α-fetoprotein v krvi bolnikov s hepatomi. Te študije so zaznamovale začetek nove faze v študiji dejavnikov, povezanih z rastjo malignih tumorjev, v 20. stoletju pa je prišlo do odkritja vrste različnih spojin, imenovanih »tumorski markerji«. Klinični biokemiki se pogosto uporabljajo za prepoznavanje primarnega tumorja in njegovih metastaz. Označevalci maligne rasti vključujejo snovi različne narave. Med njimi je več kot 200 spojin: antigeni, hormoni, encimi, glikoproteini, lipidi, proteini, presnovki, katerih koncentracija je povezana s tumorsko maso, njeno proliferativno aktivnostjo in v nekaterih primerih s stopnjo malignosti neoplazme. Nenormalna ekspresija genoma je eden od glavnih mehanizmov nastajanja označevalcev s tumorskimi celicami, ki določa sintezo embrionalnih, placentnih in ektopičnih beljakovin, encimov, antigenov in hormonov.

Kot idealen test za zgodnjo diagnozo malignih tumorjev so predlagali številne označevalce, vendar doslej še ni bilo mogoče najti rešitve. Težave zaradi raznolikosti zahtev za idealen marker. Idealni tumorski marker naj proizvaja tumorska celica v zadostnih količinah, tako da jo lahko določimo s sodobnimi metodami. Ne sme biti prisoten pri zdravih ljudeh in pri benignih tumorjih,

marker je treba zaznati v zgodnjih fazah tumorskega procesa, število tumorskih markerjev mora biti neposredno sorazmerno s prostornino tumorja, ta marker pa je treba določiti pred kliničnimi manifestacijami tumorja, raven idealnega markerja naj korelira z rezultati antitumorskega zdravljenja.

V kliničnih študijah so uporabljeni številni dovolj učinkoviti tumorski označevalci, ki pa ne izpolnjujejo vseh zgoraj navedenih meril. Sodobne biokemijske in imunološke metode lahko razkrijejo tumorje, kadar pogojno število tumorskih celic doseže 10 9 -10 10, minimalna raven markerja, ki ga izloči tumor, pa je od enega do več femtomolov (vse številke temeljijo na 1 ml krvnega seruma). Visoko učinkovitost uporabe tumorskih markerjev v kliniki lahko dosežemo s kombinacijo različnih testov. Opozoriti je treba, da se število predlaganih markerjev za diagnozo in spremljanje malignih tumorjev nenehno povečuje, prihaja pa tudi do stopnje kritične presoje z namenom oblikovanja strategije in ustrezne uporabe.

4.4.1. RAZLAGA REZULTATOV PRESKUŠANJA TUMORSKIH MARKERJEV

Določanje koncentracije tumorskih označevalcev v različnih novotvorbah zahteva poznavanje dejavnikov, tako in vivo kot in vitro, ki vplivajo na rezultate ali jih izkrivljajo. To je treba upoštevati tudi ne le za laboratorijske zdravnike, ampak tudi za zdravnike, ki so neposredno odgovorni za opazovanje in zdravljenje posameznega bolnika. Naslednji so glavni dejavniki, ki vplivajo na definicijo tumorskih označevalcev.

• stopnja izražanja in sinteza markerja;

• sproščanje markerjev s tumorskimi celicami;

• zdravila in kemoterapevtiki;

• izločanje iz telesa;

• intenzivnost prekrvavitve tumorja;

• položaj pacientovega telesa med odvzemom krvi;

• instrumentalne in ne-instrumentalne metode (npr. Bronhoskopija ali biopsija);

• katabolizem tumorskih markerjev (npr. Funkcionalno stanje jeter in ledvic);

• slabe navade (kajenje, pitje alkohola). In vitro:

• pogoji shranjevanja vzorcev;

• časovni interval med zbiranjem krvi in centrifugiranjem (z ločitvijo seruma);

• stopnja hemolize in rumenkost;

• stik krvnih žil s kožo;

• kontaminacija vzorca s slino;

• vpliv drog;

• prisotnost protiteles proti glodalskim imunoglobulinom v krvi bolnikov (po diagnostični imunoscintigrafiji in imunoterapiji);

• metodološka napaka pri določanju tumorskega markerja. Treba je upoštevati, da večina kroži

markerji krvnega tumorja niso primerni za pregledovanje bolnikov v odsotnosti simptomov, saj obstajajo številne omejitve, povezane s pogosto nizko diagnostično občutljivostjo in specifičnostjo, kot tudi omejeno napovedno vrednost. Hkrati pa obstaja več priznanih primerov, ko je težko upravljati brez definicije tumorskih označevalcev.

To je, prvič, ocena učinkovitosti zdravljenja. V zgodnjih fazah lahko spremembe koncentracije tumorskega markerja pokažejo, ali bo izbrana kemoterapija uspešna ali (v primeru stalnega povečanja koncentracije) potrebna korekcija terapije, do odpovedi. Seveda je testiranje tumorskega markerja povsem nesmiselno v hudih primerih raka.

Drugič, spremljanje poteka bolezni. Uporaba tumorskih markerjev za spremljanje poteka neoplazme pogosto omogoča odkrivanje metastaz in / ali ponovitev tumorjev za 3-5 mesecev ali več pred kliničnimi manifestacijami bolezni. Pri nekaterih bolnikih lahko testiranje tumorskih označevalcev po kirurški odstranitvi primarnega tumorja povzroči občutljivejše spremljanje kot endoskopija, ultrazvok ali računalniška tomografija. Stopnja povečanja ravni tumorja

označevalec vam običajno omogoča sklepanje o številnih opažanjih

- naravo napredovanja bolezni, zlasti o metastazah. Poznavanje narave sprememb v ravni tumorskega markerja vam omogoča tudi optimizacijo časa naknadnega podrobnega pregleda pacienta. Medtem ko ohranja nizko ali normalno raven tumorskega markerja za dovolj dolgo časa, se spremljanje, vključno z invazivnimi ali dragimi tehnikami, zdi odveč. Nasprotno, če se stopnja tumorskih označevalcev poveča in so potrebne informacije o napredovanju bolezni pri odločanju o taktiki zdravljenja, so prikazane takšne študije.

Tretjič, identifikacija ostankov in ponavljajočih se tumorjev. Neustrezno šibko znižanje ravni tumorskega označevalca ali odsotnost zmanjšanja na splošno kaže na nepopolno odstranitev tumorja ali prisotnost več tumorjev (metastaz). Te informacije imajo lahko terapevtski in prognostični pomen.

In končno, četrtič, napoved poteka tumorskega procesa. To je izredno intenzivno razvijajoče se sodobno področje uporabe tumorskih označevalcev, predvsem tistih, katerih raziskave so povezane z napovedjo in zato v prvi vrsti vplivajo na izbiro terapije.

4.4.2. COLORECTAL RAC

V evropskih državah se zboli rak debelega črevesa in danke

1 od 20 ljudi. Manj pogosto se ta vrsta raka nahaja v Afriki in delih Azije. Zdaj v Rusiji se stopnja odkrivanja CRC monotono poveča.

Trenutno je uporaba molekularnih metod pri diagnozi CRC zelo obetavno in pomembno področje raziskav, to pa je posledica dejstva, da je treba dogodke, ki se pojavijo na ravni genomov, obravnavati kot ključno pri pojavljanju in napredovanju teh tumorjev. Obstajajo številna zanesljiva dejstva, ki kažejo, da se CRC v zgodnjih fazah razvoja lahko in mora določiti z molekularnimi metodami. Metode molekularne diagnoze CRC vam omogočajo tudi predpisovanje ustreznega zdravljenja in natančno predvidevanje rezultata.

CRC nastane kot posledica zaporednih sprememb (displazija / adenom-adenokarcinom), ki temeljijo na genetskih

kršitev. Vendar mehanizmi, ki so odgovorni za pojav in kopičenje takšnih motenj v epitelnih celicah, niso popolnoma razumljivi. Primer težav pri proučevanju tega problema je dejstvo, da obstajajo razlike v pogostnosti pojavljanja benignih in malignih faz bolezni, in sicer pri zaporedju displazije / adenoma-adenokarcinoma. Dokazano je, da se pri več kot polovici populacije do devetega desetletja življenja pojavijo kolonektalni adenomi, CRC pa le pri 5% populacije. Posledično se le nekaj predrakavih sprememb spremeni v rak.

Torej, skupaj s starostjo in kroničnimi vnetnimi boleznimi (ulcerozni kolitis, Crohnova bolezen ali vpletenost debelega črevesa s shistosomiozo), je CRC v krvnih sorodnikih priznan, če ne glavni dejavnik tveganja. Vzroki, ki povzročajo CRC pri enem družinskem članu, se lahko razlikujejo od redkih avtosomno prevladujočih sindromov z visoko incidenco CRC (družinski adenomatozni polipozi, dedni nepolipični CRC sindrom) do manj genetsko jasnih pogojev, kot je na primer odkrivanje adenoma v najbližjem sorodniki (staršev, brat ali sestra ali otrok). Znano je, da se je CRC pojavil v mlajših letih, višje je statistično tveganje njegovega pojava pri bližnjih sorodnikih. Dedni sindromi CRC so predstavljeni v tabeli. 4.6 glede na fenotip in mutacije v zadevnih genih.

Opozoriti je treba, da je študija molekularnih mehanizmov, ki so osnova redkih dednih sindromov, pripomogla k razumevanju patogeneze sporadičnega CRC, ki je v populaciji opazno pogostejša, vendar temelji na podobnih ali podobnih molekularnih dogodkih.

Vloga molekularno genetskih motenj pri pojavu CRC in predvsem nestabilnosti genoma se je intenzivno preučevala relativno pred kratkim. Leta 1993 je bila ugotovljena mikrosatelitna nestabilnost (MSI) pri družinskih članih z dednim rakom kolona (RTC). To odkritje je služilo kot osnova za hipoteze o mutacijskem fenotipu raka, ki ga je razvil Loeb, po katerem mora celica preživeti različne mutacije, da bi postala rakasta. Ampak za to naj bi na začetku imeli sposobnost, da mutirajo pogosteje kot običajno, in to lahko nato

Tabela 4.6. Dedni sindromi CRC

Tabela 4.7. Vrste genskih motenj in molekularni markerji v CRC

povezati z inaktivacijo mehanizmov, ki so odgovorni za normalno ohranjanje strukture DNA.

V skoraj vseh primerih RTK se ugotavlja kromosomska nestabilnost ali nestabilnost MSI. Pravzaprav je med obema kršitvama obratna povezava. Tako so maligni tumorji, ki imajo nestabilnost MSI, običajno diploidni in nimajo kromosomskih aberacij. Za tumorje s kromosomsko nestabilnostjo je značilna aneuploidija, ki jo pogosto spremlja izguba ali pojav dodatnih kromosomov. Tako pogosto odkrivanje kromosomske nestabilnosti ali nestabilnosti MSI v tem primeru ne kaže, da je to zelo pogost in nespecifičen pojav v procesu nastanka kakršnega koli malignega tumorja, vendar je nestabilnost genoma tesno povezana s tumorogenezo.

Tako kromosomska nestabilnost kot nestabilnost MSI je mogoče odkriti v zelo zgodnjih fazah RTK. Tako smo s primerjalno hibridizacijo genoma za določitev povprečnega števila napak med kopiranjem dokazali njihovo postopno povečanje z napredovanjem adenoma z blago displazijo do adenoma s hudo displazijo in kasnejšo transformacijo v rak (tabela 4.8).

Tabela 4.8. Kromosomska nestabilnost v primeru RTK

Bolniki z dedno nagnjenostjo zaradi motenj gena APC, vključno z motnjami v nukleotidni sekvenci in izražanjem genov, razvijejo tumorje, ki se običajno razvijejo kot posledica kromosomske nestabilnosti, za katero je značilna izguba alelov in citogenetskih motenj. Tumorji pri nekaterih bolnikih z občasnim CRC se pojavijo na enak način.

V nasprotju s tem pa pri bolnikih z dednim nepolipoznim CRC sindromom mutacije v genu, ki popravljajo napake DNA, povzročijo tumorje, za katere je značilna nestabilnost MSI, in nukleotidi, ki so odkriti kot ponavljajoče se nukleotidne sekvence, od katerih so nekatere v kodonu genov. Redko se pojavlja izguba alelov. Ta vrsta molekularne patologije je opažena tudi v približno 15% primerov sporadične CRC in je pogosto povezana z anatomskimi značilnostmi, kot je lokacija v proksimalnem črevesju (naraščajoče debelo črevo); nizka diferenciacija tumorskih celic s sluzjo, medularno ali cricoidno-celično komponento; prisotnost velikega števila limfoidnih foliklov z zarodnimi središči na periferiji tumorja; infiltracija tumorja limfocitov.

Neučinkovita transkripcija genov kot posledica aberantnega metiliranja citogenetskih sekvenc gvanina (C-G otoki) v promotorskih regijah genov se trenutno obravnava kot ena od komponent molekularne patogeneze tretje CRC podvrste.

Uporaba molekularnih diagnostičnih metod pri pacientih ima velik potencial tako pri zgodnji diagnozi kot pri oceni tumorskega odziva na terapijo in pri prognozi bolezni. Kot je prikazano v tabeli. 4.9, s tako diagnozo, lahko uporabite različne predmete študija.

Pri bolnikih, ki že imajo CRC, se lahko molekularne metode uporabijo za identifikacijo mikrometastaz, za natančnejšo oceno stopnje tumorskega procesa, zlasti za odkrivanje mikrometastaz v bezgavkah ali za oceno možne hematogene diseminacije tumorskih celic v kostnem mozgu.

Poleg tega ima molekularna diagnostika velik potencial za odkrivanje genotipskih in fenotipskih značilnosti tumorja, ki določajo celotno verigo dogodkov, ki vodijo v metastaziranje celic, tako imenovani metastatski

Tabela 4.9. Uporaba molekularnih diagnostičnih metod za CRC

genotip in fenotip. Označevalci tega tipa lahko kažejo na večjo verjetnost napredovanja tumorskega procesa po radikalni operaciji.

Opredeljene so genetske nepravilnosti, povezane z napovedjo ali odzivom na kemoterapijo za CRC, vključno z izgubo alela pri 18q, izginotjem izražanja genskega izdelka DCC, nenormalnostmi gena p53, izgubo alelov na kratki roki kromosoma 1 in 5, mutacije RAS. Študije klinične učinkovitosti uporabe takšnih molekularnih markerjev so bile prepričljivo formulirane, trenutno se izvajajo in vključujejo reprezentativni vzorec prebivalstva. Za široko uporabo v klinični praksi morajo študije molekularnih markerjev izpolnjevati vse zahteve za rutinske laboratorijske teste, kot so obnovljivost, razpoložljivost in ustrezen nadzor kakovosti. Končno, klinični zdravniki bi morali rezultate študij molekularnih markerjev zlahka razlagati in imeti terapevtsko vrednost.

Kompleksnost in večstopenjski genetski in biokemični procesi, ki se pojavljajo v rakavih celicah, ki jim omogočajo metastaziranje, otežujejo interpretacijo vrednosti teh markerjev. Poleg tega dejavniki, ki niso neposredno povezani s tumorjem, kot je kakovost kirurške tehnike, pomembno vplivajo na končni rezultat. Med tumorskimi markerskimi geni, ki napovedujejo terapevtski odziv, je bila pozornost usmerjena na p53 in apoptozno regulirane gene, ki jih regulira p53.

Eno od področij molekularno genetske študije tumorjev je identifikacija molekularnih motenj, značilnih za kasnejši razvoj metahronskih tumorjev, ki se včasih pomotoma štejejo za ponovitev glavnega tumorja. Tovrstne študije vključujejo študijo kolorektalnih adenomov kot tarče za identifikacijo markerskega gena zaradi njihove visoke frekvence v populaciji kot predrakavih sprememb v primerjavi z nizko pogostnostjo odkrivanja malignih tumorjev. Molekularni marker, ki kaže na visoko verjetnost razvoja metakronskih adenomov, zlasti adenomov, ki se lahko preoblikujejo v maligni tumor, je lahko koristen za identifikacijo rizičnih skupin za kasnejši kolonoskopski pregled.

V nasprotju s tem pa je mogoče pri presejanju izključiti tiste bolnike, pri katerih metahronski adenomi verjetno ne bodo napredovali. Strategija odstranjevanja adenoma je pokazala, da je povezana z zmanjšanjem pogostnosti CRC in da so lahko koristni molekularni markerji, ki identificirajo bolnike z večjim tveganjem.

Velik potencial ima tudi študija vzorcev blata in krvi. Tako je uporaba zelo enostavnega testa za skrito kri v blatu zmanjšala smrtnost zaradi CRC, vendar je njegova specifičnost še vedno razmeroma nizka. Molekularni testi za odkrivanje v blatu tumorskih fragmentov DNA so bolj progresivni. Številne študije so pokazale, da se lahko mutacije, ki vsebujejo DNK, identificirajo v blatu in krvi bolnikov s tumorji s temi mutacijami. Diagnoza tumorjev, presejanje in dinamično opazovanje bolnikov se lahko bistveno izboljša, če se odpravijo določene tehnične težave in ko so stroški uravnoteženi.

Trenutno raziskovalci namenjajo veliko pozornosti preučevanju možnosti za uporabo molekularno-genetskih označevalcev CRC. Spodaj je podana kratka karakterizacija tumorskih označevalcev, ki se sedaj najpogosteje uporabljajo v klinični praksi.

Prvič je bil odkrit leta 1965 z rakom-embrionalnim antigenom (CEA) Gold in Freedman v študiji človeškega gastrointestinalnega tkiva in adenokarcinoma debelega črevesa. Kasnejši CEA so odkrili v serumu bolnikov s CRC. Ta prva dela so bila zelo spodbudna. Potem se je mnogim zdelo, da so našli

zelo specifičen test za diagnozo RTK. Kasneje, ko so se metode odkrivanja CEA in zbiranja kliničnih podatkov izboljšale, se je ta marker lahko izoliral tudi pri drugih tumorjih (rak trebušne slinavke, jeter, pljuč, ščitnice in nevroblastoma), pa tudi pri ne-neoplastičnih boleznih (jetrna ciroza, ulcerozni kolitis, pankreatitis, kronični bronhitis, emfizem, virusni hepatitis, divertikulitis, polipi, ledvična odpoved). Zato je pri odkrivanju CEA nemogoče popolnoma natančno reči, da ima bolnik to vrsto raka. Hkrati je CEA še vedno prva izbira za CRC in se uporablja z visoko učinkovitostjo pri spremljanju bolezni, vendar je glavna pozornost posvečena kvantitativnim parametrom metode.

Pri 99% zdravih ljudi je raven CEA manjša od 5 ng / ml. Pri CRC se občutljivost testa giblje od 25 do 80% in je odvisna od velikosti in stopnje diferenciacije tumorja ter obsega procesa. Raven CEA je v korelaciji s stopnjo tumorskega procesa. Torej, po povzetih podatkih različnih avtorjev, je v skladu s stopnjami po klasifikaciji Dukesov za antigen značilno povečanje njegove koncentracije: v stopnji A - 7,8 ng / ml, B - 30,3 ng / ml, C - 58,1 ng / ml, D - 134,3 ng / ml. Hkrati se je pogostnost odkrivanja CEA (pri pragu markerja 5 ng / ml) v skupinah bolnikov z označenimi stopnjami povečala in je ustrezala 3, 25, 45 in 65%, pri pragu vrednosti markerja> 2,5 ng / ml pa je bila ugotovljena še pogosteje z zgoraj navedenimi vrednostmi. Dukes faze in je ustrezal 28, 45, 75 in 84%. Glede na to, da se je na stopnji A in B tumorski marker povečal le pri 3-28% bolnikov, je njegova uporaba pri zgodnji diagnozi CRC problematična. Visoko diferencirani tumorji aktivneje tvorijo CEA.

Po mnenju mnogih avtorjev ima oznaka prognostično vrednost, ki je v dejstvu, da visoka začetna raven CEA v krvnem serumu (več kot 25 ng / ml) kaže na visoko tveganje za razvoj zgodnjega ponovitve CRC po kirurški odstranitvi tumorja.

Primer uporabe CEA je določitev radikalne narave kirurškega posega v CRC. Po radikalni kirurški odstranitvi tumorja se praviloma koncentracija antigena do konca 6. tedna normalizira. Če raven markerja ne pade po odstranitvi primarnega tumorja,

pomislite, da ima bolnik metastaze. Priporočljivo je določiti CEA pri bolnikih v postoperativnem obdobju po 3 mesecih 2 leti. Redno spremljanje bolnikov s CRC z vključitvijo CEA izboljšuje 5-letno preživetje. Adjuvantna kemoterapija (5-fluorouracil in levamisol) pri bolnikih s CRC lahko povzroči prehodno zvišanje ravni CEA v krvnem serumu. Pri spremljanju odziva na zdravljenje ni priporočljivo rutinsko določati CEA, vendar ni drugih testov za oceno odziva na zdravljenje pri bolnikih s CRC.

Pri večini bolnikov z RTK (79,1%) v primerjavi s kontrolno skupino (10%) so odkrili protitelesa IgM in IgG proti CEA, kar omogoča uporabo tega indikatorja kot diagnostičnega označevalca in neodvisnega prognostičnega faktorja. Hkrati je odkrivanje protiteles proti CEA v serumu bolnikov s CRC povezano z boljšo prognozo in občutnim povečanjem 2-letne stopnje preživetja.

Analiza ravni CEA v pranju debelega črevesa pred endoskopskim rutinskim pregledom je pokazala, da je ta preprost test lahko uporaben v praktični medicini za identifikacijo skupin bolnikov z velikim tveganjem za CRC.

Uporaba CEA v diagnostične namene je omejena zaradi njene nizke specifičnosti, zaradi povečanja koncentracije antigena v serumu pri ne-neoplastičnih boleznih, kakor tudi zaradi vpliva nekaterih eksogenih in endogenih dejavnikov na sintezo tega markerja. Zato se pri pregledovanju bolnikov s tumorji debelega črevesa kot marker druge izbire uporablja CA-19-9 (glej spodaj). To je še posebej pomembno v primeru REA negativnih novotvorb.

Glede na nizko občutljivost in specifičnost ni priporočljivo uporabljati opredelitve CEA pri presejalnih testih za CRC. V primeru 5-kratnega povečanja CEA v serumu in prisotnosti kliničnih težav pri bolniku je treba predlagati CRC.

Primerjalna analiza treh tumorskih markerjev (CA-19-9, CEA in α-fetoproteina) v serumu bolnikov z RTK na različnih stopnjah tumorskega procesa, pri bolnikih s kroničnim ulceroznim kolitisom in pri zdravih ljudeh je pokazala pomembno razliko med bolniki z lokaliziranim RTK in kroničnim ulceroznega kolitisa v smislu CA-19-9 in CEA, kot tudi med lokaliziranimi in generaliziranimi RTK za t

tumorskih markerjev. Vrednosti tumorskih markerjev pri kroničnem ulceroznem kolitisu niso presegle normalnih vrednosti. V lokaliziranem procesu raven CA-19-9 ne presega 1000 enot / ml, CEA - 20 ng / ml. Parametri α-fetoproteina pri bolnikih s CRC so v normalnih mejah in se praviloma povečujejo le, ko je tumorski proces generaliziran, kar ne omogoča uporabe tega markerja pri diagnozi bolezni. Pri uporabi kompleksa CA-19-9 + REA je diagnostična občutljivost 91% in znatno presega tisto pri uporabi samo enega tumorja. Pristop k instrumentalnim metodam diagnostike podatkov o definiciji tumorskih označevalcev (CA-19-9 in CEA) poveča pogostnost odkrivanja lokaliziranega CRC za 14%, med generalizacijo postopka pa za 9%.

Za tumorje, za katere je značilno neravnovesje med procesi proliferacije in apoptoze. Endotelin-1, polipeptid z 21 aminokislinskimi ostanki, ima vazokonstriktorsko in mitogeno aktivnost ter je vključen tudi v mehanizme regulacije apoptoze. Poskus je pokazal, da je endotelin-1 faktor preživetja in je sposoben in vitro za zaščito PTK celic pred FasL-inducirano apoptozo.

Pogostost odkrivanja in raven topnega antigena Fas (sFas) - zaviralec apoptoze - v serumu bolnikov z RTK je višja kot pri praktično zdravih ljudeh. Pri bolnikih z RTK z metastazami v regionalnih bezgavkah in jetrih je prišlo do povečanja vsebnosti sFas v serumu, kar omogoča obravnavo vloge sistema Fas / FasL kot možne tarče protitumorskega zdravljenja pri bolnikih s CRC.

Pokazalo se je, da visoka aktivnost kaspaze-3 korelira z velikim tveganjem za ponovitev RTK, zlasti v primerih njene desnosmerne lokalizacije. Prav tako smo odkrili korelacijo aktivnosti kaspaze-3 s celicami, ki filtrirajo tumorje CD57 +.

Pomembno vlogo pri mehanizmih regulacije apoptoze v PTK ima bcl-2, ki se običajno izraža s celicami, ki obložijo dno kriptov debelega črevesa. Pokazalo se je, da je ekspresija bcl-2 v B-stadijskih RTK Dukesih povezana z boljšim preživetjem bolnikov in zato je za bolnike, pri katerih tumorji ne izražajo bcl-2, priporočljivo izvesti adjuvantno zdravljenje.

Ekspresija imunoreaktivnega p53 v primarnem tumorju v CRC je marker visokega tveganja za ponovitev bolezni po kirurški odstranitvi bolezni in pogosteje po prvem letu opazovanja. Istočasno je bila v 47-ih ugotovljena povečana ekspresija p53, v 34,4% tumorjev pa CEA. Menijo, da je pri ocenjevanju napovedi CRC potrebno določiti oba označevalca.

Znano je, da genetske poškodbe razlikujejo primarne karcinome proksimalnega in distalnega kolona. Tako multivariatna analiza ekspresije p53 v primarnem CRC-ju pogosteje kaže povečano izražanje p53 v distalnem (58,5%) kot proksimalnem (41,7%) RTK. Ob istem času je obdobje brez relapsov manjše pri p53 + tumorjih (75 in 38%; p = 0,006). Med p53 + tumorji in njihovo distalno lokalizacijo so opazili veliko tveganje za ponovitev CRC. Zato lahko ocena ekspresije p53 v CRC služi kot marker za zgodnjo ponovitev bolezni in je povezana z lokalizacijo tumorja v organu.

Dokazano je bilo, da je neuspeh kemoterapije v CRC povezan z odpornostjo teh zdravil na več zdravil. Pokazalo se je, da je ekspresija različnih izooblik CD44 povezana z agresivnim obnašanjem tumorja in postavlja vprašanje, ali signal iz tega receptorja modulira občutljivost tumorja na zdravilo. Prav tako je bilo dokazano, da CD44 inducira aktivacijo LYN in Akt src družin tirozin kinaz. Zmožnost zatiranja apoptoze ima lahko ključno vlogo pri razvoju tumorjev kolona, kar je povezano z izražanjem CD44.

Aktivatorji in inhibitorji plazminogena

V zadnjih letih je raziskovanje metaloproteinaz zunajceličnega matriksa, ki je tesno povezano s procesi invazije in metastaziranja tumorjev, pritegnilo veliko pozornost raziskovalcev. Z razvojem metastaz bi morala obstajati veriga zaporednih dogodkov, ki bi povzročila sproščanje tumorskih celic iz njihovega prvotnega okolja in nastanek tumorskih vozlov v oddaljenih organih in tkivih. Predvideva se, da je za zagotovitev procesov invazije in metastaziranja potrebna kompleksna proteolitična veriga, vključno z različnimi proteazami. Menijo, da plazmin, ki zmanjšuje raven zunajceličnega matriksnega glikoproteina in aktivira nekatere prometaloproteaze, igra ključno vlogo v procesih invazije in metastaz, medtem ko

v večstopenjski proteazni verigi je serinska proteaza ključna pozicija - urokinazni plazminogenski aktivator (uPA), ker katalizira tvorbo plazmina iz njegovega prekurzorskega plazminogena. IRA receptor (Pc-uPA) ima prav tako pomembno vlogo, ker se, ko se uPA veže na receptor, njegova sposobnost aktiviranja plazminogena poveča. Po drugi strani pa so lahko v PTK tkivih prisotni inhibitorji uPA-PAI-1 in PAI-2. Pokazalo se je, da so ravni uPA in PAI-1 v CRC višje kot v homolognih normalnih tkivih in benignih tumorjih.

Vprašanje, ali je uPA v človeški RTK izveden iz samih rakavih celic ali elementov okoliške strome (fibroblasti, makrofagi, levkociti), je ostal dolgo časa brez odgovora. Na koncu so Harvey et al. mogoče je dokazati, da aktivator izvira iz samih rakavih celic in da ni izposojen od elementov strome, antigen pa je najintenzivnejši v apikalnem in bazalnem območju PTK celic.

Najbolj reprezentativno študijo komponent aktivacijskega sistema plazminogena v vzorcih CRC so opravili Fujii et al. Prav tako so analizirali ekspresijo uPA in PAI-1 genov z metodo PCR. Izražanje UPA je bilo ugotovljeno pri 58,8% tumorjev. Pri bolnikih s pozitivnimi uPA in negativnimi rezultati za PAI-1 je bila 5-letna prognoza preživetja bistveno slabša. Multivariatna analiza je pokazala, da so rezultati sočasne določitve uPA in PAI-1 v CRC neodvisni prognostični kazalci.

Preživetje bolnikov po operaciji ni povezano z vsebnostjo uPA v stromi tumorja, vendar je bil opažen vzorec glede na njegovo raven v tumorskem epiteliju, t.j. določitev ravni uPA je lahko tudi test za diagnosticiranje RTK brez metastaz, kot tudi tveganje za zgodnjo relaps po operaciji. Možno je, da so proteaze lahko tarče zdravil, ki preprečujejo invazijo in metastaze CRC.

Jetrne metastaze so pomemben dejavnik, ki omejuje napoved pri bolnikih z RTK. Obstaja povezava med iRA in jetrnimi metastazami. Transdukcija tPA gena v PTK celice je lahko koristna v smislu preprečevanja jetrnih metastaz.

V kliničnem smislu je najmanj raziskana komponenta aktivacijskega sistema plazminogena za Rc-uPA, ki je membransko vezan tri-domenski glikopeptid. To

receptor lahko obstaja tudi v topni obliki (rRc-uPA) v ekstraktih tumorja, kot tudi v krvni plazmi zdravih ljudi in bolnikov z rakom. Topna Rc-uPA v plazmi je praktično nespremenjena molekula, toda niti natančen mehanizem njegovega sproščanja s celične površine niti njegova biološka funkcija ni v celoti raziskana. Zvišane ravni rRs-uPA v plazmi so odkrili pri bolnikih z RTK in koncentracija rRs-uPA je povezana z napovedjo bolezni. Možno je, da lahko Pc-uPA pomembno prispeva k izboljšanju angiogeneze okoli tumorja, kot tudi do mikrovaskularnih metastaz.

Tako je povečana ekspresija Rc-uPA, ki je značilna za invazivno sposobnost tumorja in vitro vsaj v nekaterih subpopulacijah RTK celic, delno posledica stalnega aktiviranja signalne kaskade, ki je odvisna od mitogen-aktiviranih protein kinaz.

Receptorji rastnega faktorja

Eden od pomembnih regulativnih sistemov za mitogeno signalno transdukcijo je družina receptorjev tirozin kinaze - produktov onkogenov c-erbB, ki vključuje štiri transmembranske receptorje s podobno strukturo - receptor za epidermalni rastni faktor (EPRF ali ErbB1), kot tudi ErbB2 (HER2 / neu)., ErbB3 (HER3) in ErbB4 (HER4). Poleg strukture se ti receptorji razlikujejo v relativni specifičnosti in afiniteti za različne običajne ligande. Po aktivaciji, ki je posledica vezave liganda in dimerizacije, se aktivira interna receptorska tirozinska kinaza in pridobi sposobnost fosforiliranja tako samega receptorja kot drugih celičnih proteinov, ki sodelujejo pri prenosu mitogenega signala.

Različni faktorji rasti so vključeni v avtokrino in parakrinsko regulacijo proliferacije CRC celic. V zadnjih letih je klinično pomembnost receptorjev rastnega faktorja in njihovih ligandov aktivno proučevano v CRC, predvsem RESR, receptorju za faktor rasti podobnega insulina tipa 1 (RIGR-1), receptorju za vaskularni endotelijski rastni faktor (R-VEGF).

REFR je onkogenski produkt c-erbB1, ki je transmembranska tirozinska kinaza, najbolj raziskana v kliničnih izrazih za to skupino v tumorjih različne lokalizacije, vendar ni dovolj raziskana v CRC.

Receptorji družine ErbB lahko tvorijo tako homo- kot tudi heterodimere, v mnogih primerih pa so najbolj aktivne heterostrukture, pri katerih sodeluje drugi predstavnik te družine, HER2 / neu, ki nima svojega liganda. Tako je HER2 / neu ključni element pri prenosu mitogenih signalov rastnih faktorjev, podobnih EGF, in njegova blokada lahko znatno upočasni ali ustavi rast tumorjev, ki so odvisni od takih dražljajev. Domneva se, da lahko povečana ekspresija HER2 / neu v tumorjih, vključno s CRC, služi kot marker občutljivosti in cilj za bolj učinkovito bioterapijo teh tumorjev. Klinične študije so v teku in v literaturi so predstavljene predhodne študije o izražanju HER2 / neu v prognozi tumorjev prebavil.

RIFR-1 in RIFR-2 sta potencialna mitogena in močni stimulatorji rasti tumorskih celic. Učinke, ki spodbujajo rast obeh tipov FGID, posredujejo predvsem FGED-1. Doslej še ni enotnega mnenja o klinični vrednosti RIFR-1 v CRC.

Večina študij je pokazala obratno razmerje med odkritjem receptorjev za steroidne hormone (endokrini tip regulacije) in EGFR (avto in parakrinsko regulacijo) v tumorjih.

Blokiranje kateregakoli od stopenj prenosa mitogenega signala rastnih faktorjev lahko načeloma povzroči moteno regulacijo proliferacije tumorskih celic in potencialno zaviranje rasti tumorja. Poskus je že raziskal dovolj veliko število zdravil, ki vplivajo na zgoraj navedene procese: specifične in nespecifične zaviralce vezave EGFR na ligande, inhibitorje tirozin kinaze in drugih kinaz, blokatorje vezanja SH2 domen efektorskih proteinov z aktiviranim receptorjem, spojine, ki zavirajo aktivacijo ras gena, vključno z inhibitorji farnesilacije. Večina jih je v fazi klinične študije, čeprav so nekateri, zlasti Herceptin, že opravili klinične preiskave in so se izkazali za zelo učinkovite pri nekaterih vrstah tumorjev.

Znano je, da so RTK ciljna tkiva steroidnih hormonov in v 25-60% primerov ohranijo funkcionalno sposobnost primarne povezave mehanizma delovanja enega ali več steroidov, in sicer estrogenskih receptorjev (RE; 40,9%), androgenov (RA; 15,5%). ), progesteron (RP; 32,6%) in glukokortikoidi (WG; 59,1%).

Kot merilo za ugodno prognozo 10-letnega preživetja bolnikov s KCR pa lahko uporabimo le prisotnost ER in RP v tumorju. Istočasno pa se ponovno odkrijemo pri RTK pri ženskah (60,5%) kot pri moških (39,5%), lokalizirana stopnja bolezni (63,1%) in tumor v desnem kolonu (59,4%).

Tumorski označevalci angiogeneze

Raziskovalci so v zadnjih letih pokazali velik interes za preučevanje angiogenih faktorjev v tumorju in zlasti v VEGF. Vse več je dokazov, da so metastaze na različnih stopnjah tumorskega procesa odvisne od stopnje vaskularizacije tumorja.

Pri hematogenih metastazah morajo tumorske celice prilepiti na endotelijske celice, preiti v lumen posode, preživeti v krvi, se ustaviti v določenem organu ali tkivu in tam tvoriti kolonijo. Visoki angiogeni primarni tumorji, vključno s CRC, z visoko intratumoralno vaskularno gostoto bodo verjetno proizvedli angiogeni klon v oddaljenem organu, ki pod ugodnimi pogoji lahko oblikuje metastaze. Večina raziskovalcev meni, da je visoka stopnja vaskularizacije tumorja statistično pomemben marker za prisotnost metastaz v regionalnih bezgavkah. V 77% predhodnih študij so ugotovili pomembno povezavo med tumorsko angiogenezo in razvojem oddaljenih metastaz. Čeprav obstajajo pomembne razlike v preučevanih skupinah bolnikov in metodah, ki se uporabljajo za oceno angiogeneze, je večina raziskovalcev pokazala obratno razmerje med vaskularizacijo tumorja in preživetjem bolnikov s CRC. Poleg tega nezadostna vaskularizacija in posledično njena hipoksija povečata izražanje genov, povezanih z odpornostjo (Pg-glikoprotein, hidrofolat reduktaza) na kemoterapijo in predstavljajo pomembno neučinkovitost neoadjuvantnega sevanja in kemoterapije.

Pri večini bolnikov (73,4%) z regionalnimi metastazami v bezgavkah je bilo obdobje brez relapsa značilno višje v odsotnosti ekspresije VEGF in nizkega indeksa SPF (frakcija S-faze) v tumorju. Poleg prognostičnega pomena VEGF je bilo dokazano, da blokiranje receptorja VEGF-2 zavira rast metastaz CRC v jetrih.

Trenutno ima več kot 200 spojin angiogeno aktivnost in vse je mogoče razdeliti v dve skupini glede na inhibitorni učinek. Prva skupina vključuje spojine, ki vplivajo na prenos angiogenskih signalov s pomočjo endotelijskih celic (antagonisti endotelijskih rastnih faktorjev, zaviralci produkcije angiogenih faktorjev, migracije endotelijskih celic), druga pa spojine, ki vplivajo na proliferacijo endotelijskih celic. Najbolj obetajoča antiangiogena zdravila, kot so marimastat, batimastat - inhibitorji matriksnih metaloproteinaz, SU 6661.

Treba je opozoriti, da se je v zadnjih letih naše znanje o bioloških procesih, ki so vključeni v nastajanje novih mikrovislov v tumorju, bistveno povečalo. Čeprav se še vedno oblikujejo prognostična in terapevtska načela, se že napreduje v razumevanju patofizioloških mehanizmov neoangiogeneze v tumorjih v klinično prakso.

Raven timidilat-sintetaze v tumorju velja za enega najbolj učinkovitih označevalcev odpornosti na zdravilo in prognozo CRC. Encim je potreben za sintezo DNA in katalizira metilacijo deoksiuridin monofosfata v deoksitimidin monofosfat kot kofaktor za 5,10-metilentetrahidrofolat (5,10-CH2FH4). Znano je, da 5-fluorouracil (5-FU), eden izmed najbolj razširjenih antimetabolitov pri zdravljenju tumorjev v prebavilih, pri dajanju bolniku tvori 5-fluoro-2'-deoksiuridin-5'-monofosfatne oblike, ki se kovalentno vežejo na timidilat sintazo in tako blokirajo. Sintezni proces DNA v tumorju. Študija ekspresijskih indikatorjev timidilat-sintetaze v tumorjih bolnikov s CRC je omogočila, da se v tej skupini bolnikov šteje za neodvisen prognostični dejavnik. Istočasno so bile 10-letne stopnje preživetja bistveno nižje pri bolnikih, pri katerih je bila odkrita tumorska ekspresija encima.

Na podlagi retrospektivne multivariatne analize in visoke stopnje zanesljivosti rezultatov, po definiciji, pri izražanju timidilat sintaze v tumorjih, lahko ta marker v kliniki uporabljamo kot neodvisni faktor napovedi za lokalno ponovitev, oddaljene metastaze, obdobje brez relapsa in skupno preživetje bolnikov z RTK.

Najboljša prognoza je bila pri bolnikih s TRK z nizko ekspresijo timidilat sintetaze v primarnem tumorju. Istočasno so raziskovalci prepričljivo dokazali, da nobenih drugih prognostičnih dejavnikov, vključno s starostjo, spolom, stopnjo diferenciacije tumorja, izražanja p53, ni mogoče obravnavati kot neodvisne označevalce prognoze, še posebej recidiva te bolezni.

Stopnja ekspresije timidilat sintetaze v primeru generaliziranega ali ponavljajočega se CRC je lahko marker občutljivosti tumorja na 5-FU. Pogosteje so bile najvišje ravni izraženosti encima ugotovljene pri abdominalnih metastazah CRC (82%) v primerjavi z metastazami tumorja v jetrih (47%). Menijo, da je to treba upoštevati pri napovedovanju občutljivosti diseminiranih oblik tumorja na 5-FU in individualno spreminjanje strategije kemoterapije pri bolnikih.

Pokazalo se je tudi, da ekspresija timidilat sintetaze in timidin fosforilaze v tumorjih nezdravljenih bolnikov s CRC nima samo prognostične vrednosti pri izbiri 5-FU kemoterapije skupaj s proliferacijskimi označevalci kot p53 in Ki-67, temveč tudi s kazalniki preživetja brez bolezni in celotnega preživetja. Istočasno je bila aktivnost teh dveh encimov proučevana z biokemično metodo v sveže zamrznjenih tumorskih vzorcih in njihova ekspresija je bila primerjana z imunohistokemijsko metodo v parafinskih odsekih skupaj s p53 in Ki-67. Prav tako je bila ugotovljena pomembna korelacija med indeksom encimske aktivnosti timidin fosforilaze in vezavno aktivnostjo 5-fluoro-2'-dezoksisiridin-5'-monofosfata (5-FU metabolita). Znano je, da sta aktivnost timidilat sintetaze in timidin fosforilaze tesno povezana s procesi angiogeneze in proliferacije v CRC. Istočasno je ekspresija VEGF pomembno korelirala z aktivnostjo timidin fosforilaze in indeksom Ki-67 v tumorju, kot tudi s trajanjem obdobja brez relapsa.

Pri proučevanju dihidropirimidinske dehidrogenaze, prvega encima, ki presnavlja 5-FU v 5-fluorodihidrouracil, je bilo ugotovljeno, da se lahko indeks ekspresije tega encima v tumorju uporabi kot marker pri ocenjevanju občutljivosti CRC na 5-FU.

Visoka aktivnost inducirane sintetaze dušikovega oksida lahko služi kot marker agresivnejšega toka CRC.

Predlaga se uporaba zelo občutljive in specifične metode za določanje aktivnosti telomeraze v epitelnem

CRC celice, ki krožijo v krvi. Aktivnost encimov smo odkrili pri 72% tumorjev na stopnjah C in D (klasifikacija Dukes) CRC. Menijo, da se lahko ta marker v tej minimalno invazivni metodi uporablja pri zgodnji diagnozi, prognozi in spremljanju bolnikov s TCR.

Ugotovljeno je bilo, da povečana ekspresija fosfataze CDC25B v CRC celicah v 43% primerov kaže na slabo prognozo bolezni. Zato ti bolniki potrebujejo adjuvantno zdravljenje. Menijo, da lahko CDC25B služi kot neodvisni prognostični marker in celo kot kontrolni faktorji, kot so metastaze v regionalnih bezgavkah, premer primarnega tumorja, stopnja njegove diferenciacije in globina invazije. Poleg tega raven izražanja CDC25B močno kaže na možno zgodnjo ponovitev stopenj B in C CRC po Dukesih.

Nedavno so se pojavile študije, ki kažejo na možnost uporabe encima za sintezo prostaglandinov in eikozanoidov - ciklooksigenaze-2 (COX-2), znanega tudi kot prostaglandin endoperoksid sintetaza - kot marker za zgodnjo diagnozo in prognozo CRC. Eksperimentalni in klinični podatki kažejo na pomembno vlogo COX-2 pri patogenezi CRC. Prikazana je odsotnost COX-2 v epitelu normalne sluznice in ekspresije beljakovin pri 40% polipov in 80-90% malignih tumorjev kolona, kar potrjuje udeležbo COX-2 v neoplastičnih procesih in napredovanju CRC. Ugotovljena je bila pozitivna korelacija med izražanjem COX-2 in velikostjo, stopnjo tumorja po Dukesovi klasifikaciji. Povečana ekspresija COX-2 v RTC je postala osnova za poskuse uporabe njenih inhibitorjev, zlasti nesteroidnih protivnetnih zdravil, kot profilaktičnih sredstev, ki preprečujejo razvoj CRC in malignosti polipov debelega črevesa. V poskusih na živalih je bilo dokazano, da zaviralci COX-2 učinkujejo kot zaščitni učinek pri raku debelega črevesa in danke. Poleg tega so ta zdravila preprečila nastanek novih polipov in prispevala k regresiji obstoječih v debelem črevesu. Po drugi strani podatki iz nekaterih eksperimentalnih študij kažejo, da je protitumorski učinek nesteroidnih protivnetnih zdravil tudi posledica dejstva, da inducirajo apoptozo v PTK celicah in zavirajo angiogenezo v eksperimentalnih tumorjih.

Drugi markerji CRC

Na kratko, osredotočili se bomo na nekatere tumorske označevalce, katerih uporaba se zdi obetavna za CRC.

Raven ekspresije MUC1 v tumorjih se lahko uporablja kot marker pri ocenjevanju napredovanja in prognoze CRC.

Ciklin-odvisen inhibitor kinaze P27 (KIP1) se lahko uporablja kot marker za odkrivanje zgodnjih faz CRC. Vendar se ne more uporabiti kot marker za zgodnje napredovanje teh tumorjev.

Tudi pred kratkim je bilo predlagano, da se pri oceni razširjenosti RTK uporabi nov marker TA90-IC, ki je prisoten v serumu v obliki krožnih imunskih kompleksov. Osnova za študijo je bilo dejstvo, da se je po mnenju mnogih avtorjev stopnja CEA povečala le pri 70% bolnikov v skupni fazi bolezni. Oddaljene metastaze so bile odkrite pri 86% pregledanih bolnikov, čeprav so mnogi od teh bolnikov klinično imeli lokaliziran tumor brez znakov generalizacije tumorskega procesa. Analiza ravni zgornjih označevalcev je pokazala, da se je koncentracija TA90-IC povečala v 82,9%, CEA pa le pri 70,2% bolnikov. Kombinacija obeh markerjev nam je omogočila ugotovitev razširjenosti tumorskega procesa v 93,5% primerov. Raziskovalci menijo, da je treba to delo nadaljevati in dokazati vlogo TA90-IC pri pregledovanju in spremljanju napredovanja CRC.

Opozoriti je treba, da je najbolj ustrezna s kliničnega vidika lahko sočasna določitev le majhnega števila komplementarnih indikatorjev, ki lahko označijo proliferativno aktivnost CRC, njen metastatski potencial, občutljivost na različne vrste centralne in lokalne regulacije. Naloga raziskovalcev na tem področju je, da izberejo optimalno kvantitativno in kvalitativno kombinacijo molekularnih markerjev v diagnozi, spremljanju in prognozi CRC.

4.4.3. Bolezni trebušne slinavke, želodca, požiralnika in jeter

V zahodni Evropi je rak trebušne slinavke odkrit v približno 10 primerih na 100 tisoč, približno 90% vseh tumorjev.

bolezni trebušne slinavke so adenokarcinomi kanalov in le 5% so nevroendokrine neoplazme in acinarni karcinom.

Najpogosteje uporabljen marker pri diagnozi raka trebušne slinavke je CA 19-9. Specifičnost njegove določitve se giblje od 76 do 99%, občutljivost pa od 69 do 93%. Vendar pa povišana koncentracija CA 19-9 v serumu ni specifična samo za adenokarcinom pankreasa. Visoka raven CA 19-9 je bila ugotovljena pri drugih boleznih prebavil (akutni in kronični pankreatitis, ciroza jeter, vnetje žolčnih vodov).

Pokazalo se je, da ima le 55% bolnikov z rakom trebušne slinavke s premerom tumorja manj kot 3 cm povečano raven CA 19-9 (> 37 U / ml). Zato je uporaba markerja CA 19-9 pri diagnosticiranju raka trebušne slinavke, zlasti njenih zgodnjih oblik, omejena, saj se njegova raven dviguje tudi z zgoraj omenjenimi benignimi procesi v jetrih in trebušni slinavki. Priporočljivo je določiti kazalnike CA 19-9 za oceno prognoze raka trebušne slinavke, ne pa tudi za rutinsko prakso.

V perspektivnih študijah so proučevali tudi številne druge oznake za rak trebušne slinavke: CA50, CA242, CA195, DU-PAN 2 mucini, CAM 17.1 / WGA. Vendar pa je treba trenutno CA 19-9 šteti za „zlati standard“ pri diagnozi raka trebušne slinavke.

Rak želodca je ena najpogostejših oblik tumorjev na svetu. V zahodni Evropi se je njegova pogostost v zadnjem desetletju zmanjšala, medtem ko se je v Aziji stopnja smrtnosti povečala in je približno 100 na 100 tisoč, v ZDA pa 6 bolnikov na 100 tisoč umrlih zaradi raka na želodcu.

Trije markerji so dovolj podrobno preučeni za rak želodca: CEA, CA 19-9 in CA 72-4, toda CA 72-4 velja za najbolj občutljivo in specifično. CEA in CA 19-9 imata enako specifičnost, čeprav je lahko CA 19-9 bolj občutljiv kot CEA, vendar pa nobeden od zgoraj navedenih markerjev ni mogoče uporabiti pri presejanju in zgodnji diagnozi raka želodca.

Pojavnost raka požiralnika se zelo razlikuje. Tako je v osrednji Aziji incidenca med njimi 50-100 primerov na 100.000, medtem ko je v Evropi in ZDA - 2-3 primerov na 100.000.V 90% karcinoma požiralnika predstavlja karcinom skvamoznih celic in v manj kot 10% adenokarcinom.

V primerjavi z drugimi gastrointestinalnimi tumorji biokemični označevalci raka požiralnika niso dovolj raziskani. Vendar pa se domneva, da je treba SCC in citokeratine (CYFRA 21-1, TPA, TPS) obravnavati kot najboljše markerje pri diagnozi raka požiralnika iz skvamoznega epitela, medtem ko je CA 19-9 prednostna pri diagnozi adenokarcinomov požiralnika. Vendar pa so tumorski označevalci pri diagnozi tumorjev požiralnika zaradi njihove nespecifičnosti dobili malo pozornosti.

Drugo ime za to bolezen je »maligni hepatom«. Takšna diagnoza je narejena v zahodni Evropi s pogostostjo 5-10 primerov na 100 tisoč, v južni Evropi pa manj kot 5 na 100 tisoč..

Glavna oznaka pri diagnozi hepatocelularnega karcinoma je α-fetoprotein, ki pri pregledovanju razkriva majhne tumorje, kar prispeva k povečanju pooperativnega preživetja v tej kategoriji bolnikov. Vendar je treba opozoriti, da vloga α-FP pri presejanju za hepatocelularni adenokarcinom ni bila določena s prospektivnimi randomiziranimi študijami. Glede na zelo redko odkrivanje teh tumorjev v zahodni Evropi se verjame, da presejanje hepatocelularnega karcinoma ni potrebno. Vendar pa so od leta 1986 priporočeni ultrazvok v jetrih vsakih 6 mesecev in določanje koncentracije α-AF pri bolnikih, pozitivnih na površinski antigen hepatitisa B, kot tudi pri bolnikih s kroničnim aktivnim hepatitisom ali jetrno cirozo vsake 3 mesece. Prav tako se domneva, da je treba bolnike s trajno okužbo, zlasti bolnike z virusnim hepatitisom C, obravnavati kot ogrožene zaradi hepatocelularnega adenokarcinoma. Dokazano je, da je tveganje za razvoj tega tumorja pri virusnem hepatitisu C in jetrni cirozi 100-krat višje kot pri neinficiranih ljudeh.

Eden od pomembnih težav pri uporabi α-FP v diferencialni diagnozi hepatocelularnega adenokarcinoma so hepatitis in jetrna ciroza, pri katerih se raven tumorskega markerja prav tako poveča. Zato ločevanje fukoziliranega α-OP od normalnega α-OP z vezavo na lektine pomaga pri diferencialni diagnozi zgoraj navedenih bolezni. Identificiranje teh frakcij α-OP pomaga pri diferencialni diagnozi hepatocelularnega karcinoma. Poleg tega se lahko pri benignih boleznih stopnja α-FP začasno poveča, pri hepatocelularnem karcinomu pa se v krvnem serumu nenehno povečuje. Zato določanje α-OP večkrat v obdobju 2–3 tednov omogoča izključitev njegovih lažno pozitivnih vrednosti. Poleg tega se je nedavno pojavil nov marker pri diagnozi hepatocelularnega adenokarcinoma - des-gama-karboisnega protrombina (DCP), znanega tudi kot PIVKA II (beljakovina, ki jo povzroča pomanjkanje vitamina K). Kombinacija tega markerja z α-FP omogoča identifikacijo hepatocelularnega karcinoma pri 86% in solitarni tumor pri 78,3%, v teh primerih pa bo eden od teh markerjev pozitiven.

4.4.4. NEPREMIČNINE ŽENSKEGA REPRODUKCIJSKEGA SISTEMA

Genitalne neoplazme pri ženskah predstavljajo 15% vseh tumorjev in so razdeljene glede na stopnjo njihovega upadanja v naslednjem vrstnem redu: rak telesa maternice, jajčnikov in materničnega vratu. Toda v strukturi umrljivosti je na prvem mestu rak jajčnikov, sledi rak materničnega vratu in maternice. V ZDA se na primer vsako leto zabeleži 20 tisoč novih primerov raka jajčnikov in 12 tisoč smrti zaradi tega tumorja. Etiologija bolezni ni znana, vendar pa se kot dejavniki tveganja štejejo anovulacija, uporaba določenih kontracepcijskih sredstev in tudi družinska občutljivost.

Več kot 90% tumorjev jajčnikov je po naravi epitelijskih, t.j. nastanejo iz koelomnega epitela. Epitelni tumorji jajčnikov so razvrščeni glede na tip celic: serozni, mucinozni, endometrioidni, bistri, mešani epitelijski, nediferencirani, skvamozni. Najpogosteje se rak jajčnikov razvije iz seroznih celic.

Najboljši marker za epitelijski rak jajčnikov je mucin - CA 125. Med menstruacijo se lahko raven markerja pri ženskah poveča na 100 kU / l in več. Raven CA 125 se povečuje pri skoraj 80% bolnikov z epitelnimi tumorji jajčnikov, vendar le polovica bolnikov z rakom jajčnikov po stopnji I po mednarodni (FIGO) klasifikaciji te bolezni kaže visoko stopnjo tumorskega markerja. Nezadostna občutljivost pri zgodnji diagnozi, kot tudi odkrivanje povišanih vrednosti CA 125 pri različnih benignih tumorjih in drugih adenokarcinomih, ne omogočajo uporabe tega indikatorja kot markerja za zgodnje odkrivanje raka jajčnikov. Poleg ravni drugih markerjev (α-OP, hCG, hCGb) se lahko raven CA 125 poveča s tumorji iz celic zarodnih celic.

Prognoza raka jajčnikov je odvisna predvsem od stopnje bolezni. Preiskava CA 125 je neobčutljiva in samo 50% bolnikov z I. stopnjo bolezni ima povišano raven markerja, zato ta marker ni priporočljiv za odkrivanje sporadičnih primerov bolezni. Vendar pa je lahko določitev CA 125 v kombinaciji z ročnim rektovaginalnim pregledom medeničnih organov in transvaginalno ultrazvokom pomembna pri zgodnjem odkrivanju raka jajčnikov.

Multicentrična, prospektivna študija žensk po menopavzi s tumorji v majhni medenici in primerjava transvaginalne ultrasonografije, ročnega pregleda medeničnih organov in določitev CA 125 (prag CA 125 35 kU / l) je pokazala, da je bila diagnoza potrjena s temi metodami pri 77, 76 in 74%.. Poleg tega je bilo z uporabo regresijske analize dokazano, da je CA 125 v primerjavi z ultrazvokom bolj občutljiva, vendar je diagnostična vrednost slabša od tiste pri ročni študiji. Tumorjev se ne odkrije s kombinacijo negativnih rezultatov treh metod. Določitev ravni CA 125 pred operacijo lahko zdravnika pozove k možnemu obsegu kirurških koristi.

Znano je, da so tradicionalni prognostični dejavniki pri bolnikih z rakom jajčnikov stopnja bolezni, stopnja diferenciacije in histološki tip tumorja, velikost ostanka tumorja po paliativni citoreduktivni kirurgiji. Istočasno so multicentrične študije pokazale, da je raven CA 125 v serumu bolnikov po prvem, drugem in tretjem ciklu kemoterapije eden najpomembnejših prognostičnih dejavnikov zgodnjega pojava.

bolezen. Podaljšani razpolovni čas CA 125 ali manj kot 7-kratno zmanjšanje ravni tumorskih markerjev v prvih mesecih po zdravljenju kaže na slab rezultat. Nadaljnje študije so pokazale, da je koncentracija CA 125> 70 kU / l pred tretjim potekom kemoterapije najpomembnejši dejavnik pri napovedovanju napredovanja bolezni v naslednjih 12 mesecih.

CA 125 pri spremljanju bolnikov z rakom jajčnikov omogoča odkrivanje zgodnjega ponovnega pojava. Vendar v literaturi ni podatkov, ki bi kazali, da lahko pravočasno odkrivanje ponovitve bolezni izboljša stopnjo preživetja. Povečanje CA 125 kaže na preostalo bolezen v 94,8% primerov, vendar pa je skoraj polovica bolnikov z normalno vrednostjo markerja imela tudi bolezen (tumorska vozlišča) v skladu z "drugo-pogled" -labarotomijo. V serumu 25% bolnikov, ki imajo samo mikroskopske znake bolezni in pri 79% bolnikov, katerih premer ponavljajočega se tumorja več kot 1 cm med laparotomijo, se poveča koncentracija CA 125 v serumu.

Rak dojk

Rak na dojki je eden od glavnih vzrokov smrti žensk v zahodnoevropskih državah in med ženskim življenjem je tveganje za ta tumor 12,2%, tveganje za smrt pa je 3,6%. Obstaja veliko dejavnikov, ki so povezani s tveganjem za nastanek raka dojke: genetski in družinski dejavniki, hormonski dejavniki (zgodnja menarha, pozna menopavza, pozna prva nosečnost), prehrana, benigne bolezni dojk (večinoma povezane z atipično hiperplazijo).

Trenutno je znanih več tumorskih označevalcev za rak dojke: MIS-1 (CA 15-3), CEA, onkoproteini, citokeratini. Najpogosteje uporabljeni sta CEA in CA 15-3. Obstajajo tudi drugi člani družine genov MIS-1: MSA, CA 519, BR27-29, BRMA. Vsi imajo približno enako občutljivost in specifičnost kot tudi SA 15-3. Zato uporaba več oznak ne doda takoj informacijam, pridobljenim z uporabo CA 15-3. Številni označevalci, kot so citokeratini (TPA, TPS, CYFRA 21-1) in topni onkoproteini (c-erbB-2), se trenutno intenzivno preučujejo in so v klinični oceni.

Občutljivost tumorskih označevalcev pri bolnikih z zgodnjim rakom dojk je zelo nizka (15-35%), zato je njihova uporaba v diagnozi

pogosto težko. Seveda pa nizke vrednosti, ki iz tega izhajajo, ne izključujejo prisotnosti primarnih in metastatskih žarišč. Po drugi strani pa visoka raven markerja pri bolnikih z rakom dojk skoraj povsem kaže na prisotnost tumorske generalizacije in posameznih metastaz.

Visoke ravni CEA, CA 15-3 in drugih markerjev družine MIS-1 so jasno povezane s stopnjo raka dojke, velikostjo tumorja in vključitvijo regionalnih bezgavk v tumorski proces. Vendar še ni jasno, ali so ti označevalci neodvisni prognostični dejavniki. Poleg tega ni znano, ali bo uporaba takšnega tumorskega markerja kot indikatorja zgodnjega ponovnega pojava bolezni privedla do povečanja preživetja bolnikov brez relapsa in celotnega preživetja.

V primeru radikalnega zdravljenja raka dojke lahko v zgodnji diagnozi relapsa ugotovimo tudi serijske določitve CEA in CA 15-3. Ti tumorski označevalci se v 2 do 18 mesecih (povprečno 5,2 meseca) pojavijo pri 40-60% bolnikov s ponavljajočim se rakom dojke pred pozitivnim odzivom po rezultatih kliničnih, instrumentalnih in radioloških metod (rentgenski pregled prsnega koša, ultrazvok jeter, skeniranje okostja). Dinamično določanje koncentracij CEA in CA 15-3 velja za precej občutljiv test pri zgodnji diagnozi kostnih in jetrnih metastaz in poleg tega zmanjšuje pogostnost bolnikov z izotopskimi skenirnimi in radioizotopnimi diagnostičnimi postopki.

Označevalci tkiva pri raku dojke

V nasprotju s klasičnimi tumorskimi označevalci, določenimi v serumu, so celični ali tkivni markerji vneseni neposredno v tumorsko tkivo. Večina jih označuje nekatere biološke značilnosti tumorja, posebnosti njegovega obnašanja in regulacije, na primer hormonsko občutljivost ali nagnjenost k invaziji in metastazam. Za nekatere molekularne markerje specifična biološka funkcija še ni določena. Glavni pomen takšnih označevalcev je v tem, da označujejo biološke značilnosti vsakega specifičnega tumorja in pomagajo pri napovedovanju in individualizaciji zdravljenja bolezni.

V zavihku. 4.10 predstavljajo biološko pomembne indikatorje, ki so aktivni ali potencialni tkivni označevalci raka dojke.

Tabela 4.10. Glavne skupine tkivno-celičnih prognostičnih označevalcev za rak dojke

V splošnem primeru lahko definicija molekularnega označevalca v raku dojke ima tri praktične rezultate: 1) identifikacijo med bolniki z zgodnjimi stopnjami rizičnih skupin raka, ki zahtevajo dodatno zdravljenje, kot tudi tistimi, ki niso predmet adjuvantnega zdravljenja; 2) določitev občutljivosti na določene vrste terapije in individualizacija shem adjuvantnega zdravljenja bolnikov s skupnim procesom; 3) razvoj novih zdravil.

Steroidni hormonski receptorji, predvsem estrogenski receptorji (ER), so bili med prvimi indikatorji, vključenimi v prakso zdravljenja indikatorjev raka dojk, povezanih s kategorijo celičnih markerjev. Nekaj pozneje so bili poleg njih identificirani tudi receptorji progesterona (RP).

Prisotnost ER v primarnem tumorju dojke kaže na njeno potencialno občutljivost za terapevtske ukrepe, katerih cilj je odstraniti vir estrogenov iz telesa ali preprečiti njihove učinke (ovariektomija, uporaba antiestrogenov).

RP je zanimiv kot molekularni marker raka dojke, ne samo zato, ker je prvi element odziva celice na progestine, določanje občutljivosti na ustrezna zdravila, ampak tudi zato, ker je njegova sinteza v celicah raka dojke inducirana z estrogeni. Tako lahko prisotnost RP kaže na funkcionalno aktivnost ER.

Trenutno različne klinike in laboratoriji uporabljajo tri relativno enakovredne metode za določanje receptorskega statusa raka dojke: radioligand - ocena sposobnosti vezanja receptorjev v citosolu tumorjev; encimski imunski test - določanje koncentracije imunoreaktivnega receptorskega proteina v istih citosolih; imunohistokemično specifično obarvanje tumorskih odsekov z uporabo protiteles za receptorske proteine. Prednost prvih dveh metod je kvantitativna, kar omogoča objektivizacijo meril za ocenjevanje receptorskega statusa. Metoda radioliganda omogoča tudi oceno funkcionalne aktivnosti receptorja v eni od prvih faz njegove interakcije s hormonom, zaradi česar je napoved občutljivosti na hormone bolj zanesljiva kot pri določanju imunoreaktivnih proteinov.

Po drugi strani pa je imunohistokemična metoda po naravi polkvantitativna, vendar ima pomembno zaslugo, da lahko pri obarvanju odsekov jasno razberete

da določimo pripadnost receptorjev tumorskim celicam. Pri uporabi biokemijskih metod ta možnost ni. Poleg tega ta metoda omogoča delo z arhivskim gradivom - parafinskimi bloki in celo pripravljenimi očali, zaradi česar je to edina možna možnost, ko se je pojavila potreba po raziskavah receptorjev za steroidne hormone ali je bila realizirana dolgo časa po operaciji.

Znano je, da je hormonsko odvisna varianta raka dojke, ko sta oba ali vsaj ena izmed steroidnih hormonskih receptorjev tipizirana, označena z ugodnim potekom in pooperativno obdobje pri teh bolnikih je boljše kot v primeru receptorsko negativnih tumorjev. Kljub temu se v praktičnem kliničnem delu rezultati določanja receptorjev za steroidne hormone uporabljajo predvsem pri izbiri bolnikov, ki so občutljivi na endokrino terapijo.

Receptorji rastnega faktorja. Ta skupina vključuje tudi same rastne faktorje - beljakovine in majhne polipeptide, ki jih proizvajajo same tumorske celice in druge komponente tumorskega tkiva (fibroblasti, makrofagi in limfociti, ki infiltrirajo tumor, endotelijske celice) in spodbujajo rast proizvodnih celic (avtokrini mehanizem) ali sosednje celice (parakrine) mehanizem).

Različni faktorji rasti so vključeni v avtokrino in parakrno regulacijo proliferacije celic raka dojke: peptidi skupine EGF (α-transformirajoči rastni faktor, amfiregulin itd.), Ki medsebojno delujejo s skupnim receptorjem, insulinu podobnimi rastnimi faktorji (IGF), somatostatinom itd. v tumorjih pri bolnikih z rakom dojke. Prisotnost EGFR v tumorju mlečne žleze, zlasti v odsotnosti receptorjev za steroidne hormone, kaže na neugodno prognozo bolezni tudi v zgodnjih fazah in odpornost na endokrino terapijo. Obstajajo dokazi, da prisotnost receptorjev IGF in receptorjev somatostatina kaže na ugodnejšo prognozo raka dojke.

Vendar pa zaradi dvoumnosti rezultatov, ki so jih dobili različni avtorji, nobeden od indikatorjev, ki označujejo občutljivost raka dojke na avto in parakrine regulatorje, še ni vstopil v rutinsko klinično prakso, kot je študija o ravni receptorjev za steroidne hormone. Vendar se lahko pričakuje, da se bo v bližnji prihodnosti zanimanje za študijo EGFR pri raku dojke ponovno povečalo, zaradi dejstva, da

sproščena so bila preskušanja, zdravila, ki specifično delujejo na EGFR, monoklonska protitelesa na receptor in inhibitorje notranje tirozinske kinaze EGFR, ki izvajajo prvo stopnjo prenosa mitogenega signala.

Opozoriti je treba, da se do sedaj "zlat standard" v študiji rentgenske difrakcije obravnava kot določanje radioliganda v membranski frakciji tkiv z uporabo 125 I-označenega EGF in nadaljnje ločitve hidroksil-apatita.

Nekaj uspehov na področju praktične uporabe markerjev, povezanih z REFR-odvisno regulacijo rasti raka dojk, je bilo že doseženo po pojavu zdravila Herceptin, ki je humanizirano protitelo proti HER2 / neu, enem izmed receptorjev družine ErbB, ki ji pripada REFR.

Družina receptorjev tirozin kinaze - produkti onkogena c-erbB, ki vključuje štiri transmembranske receptorje s podobno strukturo, REFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2 / neu), ErbB-3 (HER3) in ErbB-4 (HER4) ) je eden najpomembnejših regulativnih sistemov za prenos mitogenih signalov.

Poleg strukture se receptorji ErbB razlikujejo v relativni specifičnosti in afiniteti za različne običajne ligande. Glavna značilnost vseh receptorskih tirozin kinaz je transmembranska lokalizacija in potreba po interakciji z ustreznim ligandom (aktivirnim faktorjem) za realizacijo kinazne aktivnosti in nadaljnjih bioloških učinkov. Po aktivaciji, ki je posledica vezave liganda in dimerizacije, se aktivira interna receptorska tirozinska kinaza in pridobi sposobnost fosforiliranja tako samega receptorja kot drugih celičnih proteinov, ki sodelujejo pri prenosu mitogenega signala. Receptorji družine ErbB lahko tvorijo homo- in heterodimere, v mnogih primerih pa so najbolj aktivne heterostrukture s sodelovanjem receptorja HER2 / neu, ki nima svojega lastnega liganda.

Tako je HER2 / neu edinstven predstavnik obravnavane družine transmembranskih tirozin kinaz, saj brez lastnega liganda in brez interakcije z nobenim od znanih rastnih faktorjev, ki aktivirajo sorodne receptorje, je kljub temu ključni element pri prenosu mitogenih signalov vseh EGF- podobne peptide in je potrebna za uspešno delovanje celotnega sistema.

Glede prognostične vrednosti prekomerne ekspresije ali ojačanja gena c-erbB-2, kljub velikanskemu materialu (več kot 12.000 bolnikov z rakom dojk je bilo sedaj preučenih v različnih laboratorijih po svetu), ni soglasja o napovedni vrednosti HER2 / neu. Nekateri avtorji so opazili njegov škodljiv učinek na preživetje bolnikov z rakom dojke brez relapsov brez metastaz v bezgavkah, drugi raziskovalci pa ne najdejo zanesljive povezave med temi kazalci. Objavljeni podatki kažejo, da se tumorji z ojačanim genom HER2 / neu ne odzivajo dobro na hormonsko terapijo, vendar so občutljivi na kasnejšo kemoterapijo. Trenutno velja tudi, da je treba bolnikom s HER2 / neu-pozitivnimi tumorji priporočiti intenzivnejši režim kemoterapije kot bolniki s tumorji, ki nimajo povečanega izražanja tega onkogena.

Sistem aktivacije plazminogena. Sposobnost metastaziranja in invazije je ena od temeljnih lastnosti malignih tumorjev, pri čemer je najpomembnejši mehanizem uničenje okoliške bazalne membrane in zunajceličnega matriksa s tumorsko povezanimi proteazami. Te proteaze so vključene tudi v neoangiogenezo, kar prispeva k proliferaciji novih krvnih žil v tumorju.

Centralno mesto ima proteolitična kaskada aktivacije plazmina v tumorskem tkivu. Menijo, da plazmin, ki lahko zmanjša raven zunajceličnih matričnih glikoproteinov in aktivira nekatere prometalne proteaze, kot je kolagenaza tipa IV, igra ključno vlogo tako pri lokalnem širjenju tumorja kot pri tvorbi metastaz v oddaljenih organih in tkivih. V večstopenjski verigi proteaz, ki vodi do uničenja zunajceličnega matriksa, ključni položaj zavzame urokinazni aktivator plazminogena (uPA). UPA receptor, ki se nahaja na celični površini, ima prav tako pomembno vlogo, saj se sposobnost uPA, da aktivira plazminogen, poveča, ko se veže nanj. Na splošno je proces tvorbe plazmina ciklično ojačanje, ki ga regulira mehanizem povratnih informacij.

Poleg uPA je v aktivacijo plazminogena vključen tudi aktivator tkivnega tipa (tPA), vendar se zdi, da je njegova vloga pri razvoju tumorjev nasprotna in se zmanjša na uničenje tumorskih celic.

celic in zaščito okoliških tkiv. Aktivnost IRA in tPA zavirata dva proteinska inhibitorja, ki pripadata serpinski družini, PAI-1 in PAI-2. Na podlagi eksperimentalnih in kliničnih podatkov med rastjo tumorja imata različno vlogo tudi dva inhibitorja plazminogenskih aktivatorjev: PAI-1 ščiti tumorske celice pred samouničenjem, PAI-2 pa zavira proteolitične procese v zunajceličnem matriksu.

Različne komponente aktivacijskega sistema plazminogena v tkivu dojk so lahko tako na samih tumorskih celicah kot na stromih fibroblastih, limfocitih in makrofagih ter endotelijskih celicah, ki infiltrirajo tumor. V zvezi s tem lahko domnevamo, da je aktivacijski proces plazminogena predvsem parakrin.

Raven in razmerje izražanja komponent aktivacijskega sistema plazminogena v tumorskem tkivu lahko služi kot indikator metastatske in invazivne tumorske aktivnosti, zaradi česar je biološko pomemben prognostični faktor za maligne tumorje ali kazalec tveganja za malignost pri benignih neoplazmah. Poleg tega lahko supresija aktivacije plazminogena z urokinaznim tipom na različnih ravneh postane eden od pristopov k razvoju novih vrst antimetastatske terapije, za katere je potrebna klinična uporaba za identifikacijo skupin bolnikov, ki so potencialno občutljivi na takšno zdravljenje. Razvoj takšnih zdravil se že precej aktivno izvaja v poskusnih laboratorijih in farmacevtskih podjetjih, zaradi česar je študija njihovih ciljnih beljakovin v človeških tumorjih še posebej pomembna.

Najbolj primerna metoda za oceno stopnje ekspresije komponent aktivacijskega sistema plazminogena trenutno velja za kvantitativni encimski imunski test za določanje njihove koncentracije v citosolih tkiv. Na žalost enotni pragi še niso vzpostavljeni, čeprav se mednarodne kooperativne raziskave že izvajajo v tej smeri.

Vaskularni endotelijski rastni faktor. V zadnjih letih se veliko pozornosti posveča problemu neoangiogeneze - nastanku novih krvnih žil - pri malignih tumorjih. Za razliko od vaskulogeneze je angiogeneza proces razvejanja novih kapilarnih procesov iz obstoječih krvnih žil. Dejstvo, da se tumor ne more razviti in rasti brez nastanka

ima obsežno mrežo kapilar, ki celicam zagotavljajo kisik in hranila. Študija molekularnih mehanizmov angiogeneze je omogočila premik od mikroskopske ocene gostote krvnih žil v tumorskem tkivu do študije specifičnih molekul, ki sodelujejo pri regulaciji nastajanja in rasti novih krvnih žil. Najpomembnejši pozitivni regulator angiogeneze je nedvomno VEGF, imenovan tudi faktor vaskularne permeabilnosti. Edinstvenost tega faktorja je v tem, da je za razliko od vseh drugih rastnih faktorjev mitogena le v povezavi z endotelijskimi celicami. Dokazano je, da ima VEGF ključno vlogo pri neoangiogenezi pri raku dojk.

Rezultati številnih retrospektivnih kliničnih študij, objavljenih pred kratkim, kažejo, da je ekspresija VEGF pri raku dojk bistvena za prognozo bolezni in vpliva tudi na občutljivost tumorjev na hormonsko zdravljenje in zdravljenje z zdravili. Ero visoka raven kaže slabo prognozo za zgodnji in skupni rak dojke. Poleg tega se aktivno razvijajo in raziskujejo nova zdravila z antiangiogenetskimi lastnostmi, vrednotenje aktivnosti VEGF-odvisne angiogeneze pa je lahko osnova za njihovo ciljno uporabo.

Rak materničnega vratu

Skoraj po vsem svetu je rak materničnega vratu po raku dojk drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi tumorskih bolezni. Glavni dejavniki tveganja za to bolezen so socialno-ekonomski, zgodnji poroki, veliko število spolnih partnerjev, pa tudi okužbe, ki jih povzroča humani papiloma virus (HPV) (vrste 16, 18, 31 in 45). Kazalniki 5-letnega preživetja za to bolezen so okoli 70%. Če pa se novotvorba odkrije v zgodnji fazi, se 5-letna stopnja preživetja poveča na 90%. Opozoriti je treba, da je 90% tumorjev materničnega vratu karcinom skvamoznih celic, drugih histoloških tipov pa je adenokarcinom in skvamoznocelični karcinom. Sarkomi ali nevroendokrini rak se zelo redko pojavljajo.

Pri diagnozi karcinoma skvamoznih celic materničnega vratu se uporablja kot tumorski marker SCCA antigen - beljakovina (molekulska masa 48 kD) z močno homologijo družine zaviralcev proteaz, tako imenovanih serpinov. Občutljivost metode v I. fazi bolezni je manj kot 30%, v IV. Stopnji pa 90%. Vendar pa

Izražanje SCCA se lahko poveča tudi pri drugih ploščatoceličnih tumorjih (pljučni rak, tumorji glave in vratu, rak požiralnika in vagine), benigni kožni tumorji (luskavica, ekcem), pljuča (sarkoidoza), jetra in ledvice. Ta tumorski marker se ne uporablja pri presejanju.

Za presejanje za rak materničnega vratu so bili po vsem svetu predlagani Papanicolaujev program, instrumentalne in morfološke diagnostične metode, ki diagnosticirajo predinvazivne tumorje, kot so karcinom in situ (CIS) in intraepitelijska neoplazija materničnega vratu (CIN). Do razvoja teh procesov v 10-15 letih lahko pride pred rakom materničnega vratu. Pri diagnozi zgodnjih faz se SCCA ne uporablja, ker je raven tumorskega markerja odvisna od volumna primarnega tumorja, stopnje in vpletenosti bezgavk v tumorskem procesu. Zvišane ravni SSCA pred zdravljenjem so lahko neodvisen dejavnik pri ocenjevanju metastatske lezije regionalnih bezgavk.

Visoke vrednosti markerja pred zdravljenjem kažejo na slabo prognozo pri bolnikih s skvamoznoceličnim karcinomom materničnega vratu. Nekatere študije so pokazale, da se SCCA lahko uporablja kot neodvisni prognostični dejavnik pri raku materničnega vratu. Pri cervikalnih adenokarcinomih je CA 125 uporabnejši kot prognostični dejavnik, ne pa tudi SCCA.

Marker SCCA je določen tako, da odkrije zgodnje ponovitve skvamoceličnega karcinoma materničnega vratu ter spremljanje pred neoadjuvantnim zdravljenjem in pred ponavljajočo se terapijo tumorjev. V teh primerih je korelacija 80%, kar je pomembno klinično pomembno pri izbiri bolnikov za poznejšo radioterapijo ali kirurško zdravljenje.

Rak endometrija predstavlja 50% vseh malignih tumorjev urogenitalnega trakta pri ženskah, v 80% primerov pa ga najdemo med pregledom maternice. Preživetje na stopnji I je 80%, pri IV - 10%. V 60-80% primerov imajo tumorji adenokarcinomsko strukturo.

Najpogosteje, rak endometrija poveča tumorski marker CA 125: v fazi bolezni do 22%, in v fazi III-IV - do 80%, raven markerja je nad 35 kU / l. Za zgodnje odkrivanje raka endometrija ni tumorskega markerja. Morfološke raziskave so tradicionalna metoda.

diagnostiko endometrijskega raka in tkivne vzorce, pridobljene po kiretiranju sluznice maternice.

Pri spremljanju raka endometrija se CA 125 šteje za najboljši marker, pri 60% bolnikov z zgodnjim ponovnim pojavom tumorja pa je bilo ugotovljeno, da je povečanje seruma CA 125.

4.4.5. RAK PLUČ

V gospodarsko razvitih državah je moška populacija malignih novotvorb pljučnega raka v strukturi celotne umrljivosti 21%. Rak pljuč je prototip tumorja, ki ga povzročajo kemične rakotvorne snovi. Ugotovili smo tesno povezavo med razvojem pljučnega raka in kajenjem cigaret, vendar vsi kadilci ne razvijejo raka, ampak le 5–10%, kar kaže na pomembno vlogo genetske predispozicije pri teh bolnikih. V skoraj 50% primerov je med začetno diagnozo priporočljivo kirurško zdravljenje, toda le v 70% jih je možno resektirati.

Glavni histološki tipi pljučnega raka so: skvamozne celice (PRL), adenokarcinom, karcinom velikih celic in drobnocelični rak pljuč (MRL). Opozoriti je treba, da se MRL od drugih histoloških tipov pljučnih tumorjev razlikuje po značilnostih njenega kliničnega poteka. Zato so vsi maligni pljučni tumorji razdeljeni na SCLC in na nedrobnocelični pljučni rak (NSCLC), ki sta del heterogene skupine tumorjev.

Pri pljučnem raku so najpogosteje proučevani naslednji markerji: nevronsko specifična enolaza (HCE), CEA, 19 citokeratinov fragment (CYFRA 21-1), skvamozni rakasti antigen (SCC), CA 125, tkivni polipeptidni antigen (TPA).

Nevronsko specifično enolazo smo najprej našli v možganskih nevronih in perifernem živčnem sistemu. HSE je izoencim citoplazemskega glikolitičnega encima enolaza (2-fosfo-D-glicerat hidrolaza, EC 4.2.1.11) in je sestavljen iz dveh skoraj identičnih γ-polipeptidnih verig, molekulska masa vsakega je enaka 39.000 D. V možganih, skupaj z izoformo - dimer iz podenot α-tipa in hibridni izoencim αγ, ki imata podobno afiniteto za substrat - 2-fosfoglicerinsko kislino. Enolazo, ki je vsebovala to y-podenoto (α-γ in γ-γ), smo imenovali HCE. Izoforme lahko sintetizirajo glijalne možganske celice, kot tudi večina somatskih celic.

tkiva. Sam encim se sintetizira v osrednjih in perifernih nevronih ter malignih tumorjih neuroektodermalnega izvora (SCR, nevroblastomi, intestinalni karcinoidi).

Dokazano je, da je zgornja meja HSE pri zdravih ljudeh 12,5 ng / ml. Glede na to, da so koncentracije do 20 ng / ml

in več se lahko pojavi pri benignih pljučnih boleznih, za klinično diagnostiko pa je priporočljiva višja raven mejne vrednosti praga (> 25 ng / ml). Povečanje aktivnosti HCE v serumu je bilo ugotovljeno pri 40-70% primarnega

bolnikih z IRL in 83-98% bolnikov s pogostim stanjem bolezni.

Po podatkih, ki jih je zagotovil Memorial Sloan Kettering Cancer Center (ZDA), je pogostnost povečanja aktivnosti HCE v serumu bolnikov s SCR odvisna od prevalence tumorskega procesa: pri stopnji I-II je občutljivost testa 39%, v fazi III-IV - 87%. Opozoriti je treba, da pri analizi diagnostičnega pomena mnogi avtorji ugotavljajo relativno visoko specifičnost v primerjavi z drugimi markerji. Tako se je aktivnost v emfizem povečala le v izjemnih primerih, v nasprotju s tem pa se je koncentracija CEA povečala v 7-36% opazovanj. Rezultati raziskav kažejo, da je HCE uporaben kot tumorski marker za izbiro, tako pri diferencialni diagnozi kot pri spremljanju učinkovitosti terapije za MRL.

Hkrati je bilo ugotovljeno povečanje aktivnosti HCE v serumu bolnikov s tuberkulozo (27,3%) kot tudi pri bolnikih, okuženih z virusom HIV, v primerjavi z neokuženimi. Tudi bolniki z alveolarnimi infiltrati ali intersticijskimi žarišči v pljučih so imeli v serumu pomembno povišane vrednosti HCE. Menijo, da je povečanje serumskega HSE pri bolnikih z benignimi pljučnimi boleznimi povezano z lokalno hipoksijo. Predstavljene rezultate je treba upoštevati pri analizi HCE pri bolnikih s pljučnim rakom in v obstruktivnih pljučnih procesih.

Opozoriti je treba, da je glede na pomembno heterogenost pljučnega raka, zlasti majhne celične variacije, mogoče opaziti pomemben diagnostični in prognostični pomen HCE v primerjavi z drugimi tumorskimi označevalci.

V skupino spada tudi antigen embrionalnega raka, ki ga predstavlja glikoprotein z molekulsko maso približno 180 kD.

onkofetalnih antigenov, ki jih sintetizirajo in izločajo celice črevesja zarodka in ploda, pa tudi nekateri maligni tumorji (rak dojke, želodec, pljučni rak). Prvič je bila CEA ugotovljena pri bolnikih z rakom debelega črevesa. Trenutno so na celičnih membranah zaznane tudi spojine, podobne CEA, v ne-embrionalnih in nekanceroznih tkivih. Obstaja razlog za domnevo, da so jetra glavno presnovno mesto CEA. Raven CEA v krvnem serumu se poveča pri 40-80% bolnikov z malignimi novotvorbami endodermalnega izvora, pri 20-30% z drugimi oblikami raka in pri 10-20% z benignimi tumorji. Največjo občutljivost CEA in najvišje koncentracije markerja so našli pri adenokarcinomu in velikem celičnem pljučnem raku.

Antigen serumskega skvamoznega karcinoma je beljakovina z molekulsko maso 48 kDa, ki je podobna serpinu (zaviralcem proteaz). Označevalec se uporablja pri diagnosticiranju karcinoma skvamoznih celic v različnih organih (rak materničnega vratu, požiralnika, pljuč, tumorjev glave in vratu). Več kot 70% bolnikov s PRL ima povišane vrednosti. Vendar pa se le v 26,1% ravni tumorskega markerja poveča v serumu z adenokarcinomom pljuč in se ne odkrije s SCR. Pri 87,8% bolnikov z zgodnjim recidivom PRL so opazili visoko raven SCC v serumu. Ugotavljanje izražanja SCC v imunohistokemični študiji pljučnih tumorjev je zelo praktičnega pomena.

Tkivni polipeptidni antigen je polidisperzijska zmes citokeratinov 8, 18 in 19 (molekulska masa od 20 do 45 kD), ki lahko polimerizira v raztopini, da tvori oligomere. Aktivnost TPA je odvisna od aminokislinskega zaporedja in položaja argininskega ostanka. Običajno ga najdemo v visokih koncentracijah v placenti in plodovih. TPA je lokalizirana na plazemsko membrano in endoplazmatski retikulum tumorskih celic, proizvaja se s proliferirajočimi celicami in spontano sprošča v okolje. TPA najdemo v skoraj vseh malignih tumorjih.

Fragment citokeratina 19. Pomen citokeratina za diferenciacijo fizioloških in patoloških tkiv je že dolgo znan v histopatologiji. Citokeratini so netopni celični proteini, več kot 20 jih je zdaj dobro označenih z monoklonskimi protitelesi. V nasprotju s tem

iz celotne molekule so fragmenti citokeratina topni v serumu. V testu za tumorski marker CYFRA 21-1 se za detektiranje fragmenta citokeratina 19 z molekulsko maso 30 kD uporabita dve vrsti monoklonskih protiteles (Ks 19.1 in BM 19.21). Zgornja meja normalnih vrednosti pri zdravih ljudeh je 2,3 ng / ml. Test CYFRA 21-1 ima dobro specifičnost za benigne pljučne bolezni, mejna vrednost je 3,3 ng / ml. Označevalec ima visoko občutljivost pri diagnozi NSCLC.

Ni povezovanja CYFRA 21-1 s kajenjem. Pokazali smo, da je raven CYFRA 21-1 enaka v serumu bolnikov z ne-malignimi pljučnimi boleznimi, SCLC in v kontrolni skupini. Istočasno so pri bolnikih z NSCLC, adenokarcinomom in PRL opazili bistveno višje vrednosti CYFRA 21-1. Predstavljeni podatki so potrdili visoko občutljivost in specifičnost CYFRA 21-1 pri diferencialni diagnozi med malignimi in ne-malignimi pljučnimi boleznimi ter med MRL in NSCLC. Bolniki z metastazami v bezgavkah N2 in N3 imajo najvišjo raven CYFRA 21-1 v serumu (5,6 ng / ml) (meje fluktuacije 3,2-11,5 ng / ml) v primerjavi z bolniki z N0 in N1. (3,9-10 ng / ml) (Mann-Whitneyjev U-test; p = 0,0373).

Pri vseh vrstah pljučnega raka ima CYFRA 21-1 največjo občutljivost (57,7%) v primerjavi s CEA (45,3%) in SCC (22,6%). Čeprav je kombinacija CYFRA 21-1 in CEA za diagnozo NSCLC, občutljivost in točnost povečana na 75,4 oziroma 78,1%, vendar se specifičnost zmanjša na 86,5%.

Japonski raziskovalci (Univerza Tsukuba) predlagajo, da se poleg citološke preiskave uporabi določitev ravni CYFRA 21-1 v plevralni tekočini, da bi izboljšali diagnozo in diferencialno diagnozo pljučnega raka. To je posledica dejstva, da je bilo v pljučni tekočini pri bolnikih s pljučnim rakom (84,5 ng / ml v povprečju) ugotovljeno znatno povečanje markerja v primerjavi z bolniki z benignimi tumorji (13,9 ng / ml). Poleg tega je raven CYFRA 21-1 v plevralni tekočini bolnikov s PRL bistveno drugačna od tiste pri pljučnici, medtem ko CEA ne kaže takšnih razlik.

Pri določanju CYFRA 21-1 se je treba zavedati možnega povečanja ravni do 10 ng / ml v primeru progresivnih benignih bolezni jeter in zlasti v primeru odpovedi ledvic. Lahko je tudi kontaminacija vzorca z elementi sline

znatno poveča vrednost CYFRA 21-1. V tem primeru rezultat ne vpliva na spol, starost, kajenje in nosečnost. Študije vseh vrst solidnih tumorjev so pokazale, da je CYFRA 21-1 učinkovit marker za NSCLC in PRL.

V zaključku si poglejmo nekatere značilnosti uporabe v kliniki označevalcev maligne rasti na primeru pljučnega raka.

Najprej ne smete uporabljati vseh zgoraj navedenih markerjev pri presejanju za asimptomatski pljučni rak ali pri bolnikih z velikim tveganjem za razvoj tega tipa tumorja. Primarna diagnostika in primarno zdravljenje bolnikov s pljučnim rakom temeljijo na kliničnih in instrumentalnih metodah pregleda (klinični, endoskopski, rentgenski, intraoperativni izsledki).

Poleg tega je treba pri imunohistokemični diagnozi tumorske variacije upoštevati izjemno pomembno oznako NSE. Pogosto samo določanje HCE v serumu potrjuje diagnozo SCLC.

Serumska koncentracija SCC> 2 mg / l kaže 95% možnost odkrivanja NSCLC in 80% skvamoznoceličnega raka pljuč.

Pri vrednostih CA 125 nad 100 e./ml in CEA nad 10 mg / l je treba predlagati adenokarcinom ali velik celični pljučni rak.

Nazadnje, čeprav pogosto koncentracije v serumu CYFRA 21-1, TPA, HCE, CEA kažejo na prisotnost tumorja, ni opaziti.

močna povezava med nastajanjem tumorskih označevalcev in histološko različico pljučnega tumorja. V večini primerov visoka raven v tem primeru kaže na prevalenco tumorskega procesa, zato bi morala biti napoved razočaranja. Vendar pa nizke in povprečne vrednosti teh označevalcev nikoli ne omogočajo popolne odstranitve kakršnekoli variacije tumorja ali napredovanja bolezni.

Kljub vsem zgoraj navedenim omejitvam so tumorski označevalci v primarni diagnozi pljučnega raka lahko pomembni v naslednjih primerih.

Prvič, tumorski antigeni, izraženi med začetno diagnozo, je treba uporabiti pri spremljanju pri določenem bolniku. CYFRA 21-1, REA in CA 125 so zelo pomembni prognostični dejavniki pri NSCLC in HCE v MRL.

Drugič, zmanjšanje ravni tumorskih markerjev v pooperativnem obdobju (

2-3 dni za CEA, 1 dan za NSE, nekaj ur

za CYFRA 21-1) daje zdravniku koristne informacije o radikalni naravi opravljene operacije in učinkovitosti terapije, in zato o dobri prognozi. Po drugi strani pa počasno znižanje ravni markerja v krvnem serumu kaže na ne-dikalnost opravljene operacije in nakazuje prisotnost ostankov žarišč tumorja.

Tretjič, postopno povečanje tumorskega markerja je lahko prvi znak ponovitve bolezni. Takšno povečanje je mogoče odkriti 12 mesecev pred kliničnimi znaki ponovitve bolezni. Za pljučni rak lahko HCE služi kot merilo za diferencialno diagnozo različnih histoloških tipov tumorja, zlasti v primerih, ko ni mogoče izvesti biopsije in potrditi vrste tumorja z morfološkimi podatki.

4.5. MOLEKULNA GENETSKA DIAGNOSTIKA

Glavna naloga sodobne molekularne genetske diagnostike (MHD, DNA diagnostics) je odkrivanje dednih anomalij za kasnejšo uporabo pri diagnozi, izdelava napovedi in izbira strategije zdravljenja za številne bolezni. Hkrati se MHD šteje za veliko širše kot preprosto analiziranje zaporedja humane genomske DNA, saj lahko skoraj vedno dodatne informacije o dedni bolezni dobimo tudi z analiziranjem stanja samih kromosomov in RNA ter beljakovin in metabolitov.

Tako kot druge metode klinične biokemije se genetsko testiranje uporablja tudi za diferencialno diagnozo bolezni. Pri številnih boleznih, na primer pri dednih oblikah raka ali "napakah presnove", odkrivanje mutacij postane diagnostični kriterij tako pomemben kot klinični simptomi. Seveda pa je glavna prednost DNK diagnostike sposobnost določanja občutljivosti na določeno bolezen v presimptomatskem obdobju. V nekaterih primerih to omogoča preprečevanje razvoja same bolezni s kirurškim posegom, terapijo z zdravili ali spreminjanjem življenjskega sloga bolnika. Poleg tega lahko prenatalno testiranje DNK odkrije dedovanje patoloških genov in s tem določi indikacije za umetno prekinitev nosečnosti.

Potrebno je omeniti tako perspektivno smer MHD kot farmakogenetiko. Natančna tipizacija pacientovega genotipa omogoča vrednotenje genov, ki so neposredno povezani z absorpcijo, presnovo in delovanjem zdravil, tj. Obstaja resnična priložnost za identifikacijo bolnikov, ki so posebej občutljivi na določeno zdravilo, in za preprečevanje zapletov zaradi intolerance za to zdravilo med zdravljenjem. V nekaterih primerih vam genotipizacija omogoča tudi izbiro najprimernejšega zdravila. Že lahko rečemo, da se z razvojem farmakogenetike zdravljenje z zdravili vse bolj opira na analizo bolnikovega genotipa.

Tako uporaba MHD v klinični praksi ponuja številne možnosti ne le za diagnosticiranje in ocenjevanje genetskega tveganja za bolezni, ampak tudi za izbiro posamezne zdravilne terapije. Upamo, da bo z aktivnim razvojem človeške molekularne genetike DNK diagnostika postavljena enakovredno s tako nepogrešljivimi orodji v arzenalu zdravnika biokemičarja, kot so na primer metode za določanje aktivnosti encimov v krvi.

4.5.1. VRSTE GENETIČNEGA OBNOVLJANJA

V populaciji je običajno več variant (alel) vsakega gena. Če je pogostost takšnih variant precej visoka in je ni mogoče razložiti z naključnim pojavom identičnih mutacij v različnih družinah, potem govorimo o polimorfizmu danega lokusa.

Bolj redke variante genov imenujemo mutacije. Kakšna je meja med polimorfizmom in mutacijami? Šteje se, da polimorfizem vključuje različice genov, ki jih najdemo v heterozigotni obliki več, in mutacije manj kot pri 1% populacije. V praksi pa se mutanti pogosto imenujejo aleli, ki so nagnjeni k določeni patologiji, tudi če je njihova pogostnost v populaciji nad 1%. Spodaj so navedene vrste mutacij, ki lahko povzročijo patološke spremembe.

• Najpogostejši tip mutacije so mutacije Missense ali zamenjava nukleotidov. Nadomestitev nukleotidov v nekaterih pozicijah kodona ne vodi do zamenjave kodirane aminokisline; take mutacije se imenujejo tiho ali sinonimno. Ko se kodirana aminokislina spremeni zaradi mutantne mutacije, se funkcija proteina pogosto spremeni. Ohranitev funkcije beljakovine se opazi, če

amino kislina, izpeljana iz mutantnega kodona, spada v isti strukturni razred kot normalna aminokislina. Enkratni nukleotidni substituciji imajo največji učinek na protein, kar povzroči nastanek stop kodona (nesmiselne mutacije). Okrnjena mRNA in beljakovine so pogosto neaktivne in se hitro razgradijo.

• Brisanje in vstavljanje. Takšne mutacije se razlikujejo po dolžini od enega do milijonov nukleotidov in se zato imenujejo mikro- in makro-izbrisi (vstavki). Razumljivo je, da makromutacije vplivajo na zelo velike kromosomske segmente (od 10 milijonov parov baz), t.j. mogoče jih je odkriti s citogenetsko analizo. Mikromutacije vplivajo na majhno količino nukleotidov in uporabljajo metode za analizo nukleotidnega zaporedja DNA. Majhne insercije in delecije ne smejo vplivati na funkcijo kodiranega proteina. Smrtne posledice se običajno opazijo, kadar število nukleotidov za vstavljanje / brisanje ni večkratnik treh. Ko se to zgodi, se sintetizira premik bralnega okvira in nesmiselna aminokislinska sekvenca. Najpogosteje se zelo hitro prekine z oblikovanjem novega stop kodona. Klasičen primer učinka premika okvirja na učinke izbrisa sta dve sorodni bolezni - Duchenna in Beckerjeva mišična distrofija. Oba sta posledica mutacij v genu za distrofin in 2/3 teh mutacij pri obeh delecijskih boleznih. Beckerjeva mišična distrofija je veliko blažja kot Duchenne, vendar ta razlika ni povezana z velikostjo izbrisov. Razlog za razlike je v tem, da v večini odkritih primerov Duhenneove miodistrofije delecije povzročajo premik v bralnem okviru, zaradi česar se distrofin popolnoma preneha oblikovati, medtem ko mutantni distrofin z Beckerjevo miodistrofijo ohranja določeno aktivnost.

• V nekaterih primerih mutacije vplivajo na nekodirajoče regije DNA, ki so vključene v iniciacijo transkripcije danega gena ali spajanje mRNA. Takšne spremembe lahko povzročijo tudi motnje v strukturi, stabilnosti ali normalni regulaciji izražanja tega proteina.

• Nestabilne ali dinamične mutacije se običajno razvijejo v območjih, ki vsebujejo več kopij trinukleotidnih ponovitev. Zaradi napak replikacije DNK ali neenakomernega prečkanja, se lahko število takšnih ponovitev poveča ali zmanjša, zaradi česar se takšne mutacije imenujejo dinamične. Če je številka

ponovitev presega določeno mejno vrednost, je motena funkcija danega ali bližnjih genov. Mehanizmi za izločanje genov med kopičenjem trinukleotidnih ponovitev niso povsem jasni. Zlasti pri krhkem kromosomskem sindromu X povecanje števila ponovitev CGG v FRAXA locusu nad 200 vodi do metilacije in inaktivacije tega gena. Povečanje števila ponovitev trinukleotidov je tudi osnova Huntingtonove bolezni (več kot 35 ponavljajočih se CAG v Huntingtonovem genu) in miotonične distrofije (več kot 50 ponovitev v 3'-neprevedenem območju gena DMPK, ki kodira protein-kinazo). Značilna značilnost teh bolezni je, da se v eni družini resnost bolezni lahko poveča v številnih generacijah zaradi širitve ponavljajočih se nukleotidov.

Na splošno pojav mutacij vodi do spremembe v funkciji ali ekspresiji proteina. Ta sprememba se kaže kot povečanje in zmanjšanje, pogosto do popolne izgube, funkcije ali izražanja proteina. V primeru povečanja funkcionalnosti je možno tudi, da beljakovina pridobi nove funkcije.

GIBANJA S FUNKCIJAMI IZGUB

Zmanjšanje funkcionalne aktivnosti proteina v tkivu je lahko posledica spremembe v strukturi proteina in transkripcijske aktivnosti danega gena. Na primer, zmanjšanje nivoja ekspresije LDL receptorja zaradi mutacije v promotorski regiji bo vodilo do popolnoma iste hiperholesterolemije, ki bi jo opazili, če bi se sintetizirale normalne količine funkcionalno okvarjenega receptorja, ki se ne morejo vezati ali internalizirati lipoproteinov.

Spremembe v strukturi beljakovin, ki jih povzročajo aminokislinske substitucije ali motnje pri obdelavi mRNA kot posledica mutacij v mestih za spajanje, povzročajo nastanek nenormalne mRNA in proteinov, ki so podvrženi pospešeni razgradnji, kar povzroči zmanjšanje celotne količine aktivnega proteina. Na primer, tri najpogostejše defektne alele, ki pokvarijo tiopurin metil transferazo, kodirajo hitro razgradljive beljakovine, kar povzroči močno zmanjšanje encimske aktivnosti, kar spremlja povečana občutljivost bolnikov na tiopurine. V drugih primerih, na primer pri a-talasemiji, lahko opazimo delecijo celotnega gena, kar vodi do popolne odsotnosti zdravila.

Mehanizmi izgube dejanske funkcionalne aktivnosti proteina so lahko zelo različni. Posledično lahko mutacije

nadomestitev aminokislin, ki imajo ključno vlogo v strukturi ali katalitični aktivnosti. Kot posledica mutacij se lahko prekine normalna obdelava ali transport beljakovin. Na primer, najpogostejša mutacija, ki povzroča cistično fibrozo, delecija fenilalanina na položaju 506 gena CFTR, ne vpliva na sintezo ali funkcionalno aktivnost te beljakovine, temveč moti njen znotrajcelični transport, zaradi česar ni vključena v plazemsko membrano in zato izgubi sposobnost delovanja kot kanal klora.

Praviloma mutacije z izgubo funkcije vodijo do bolezni z recesivnim načinom dedovanja. To je posledica dejstva, da je za popolno delovanje presnovne poti običajno dovolj količine aktivnega proteina, ki ga proizvaja en normalen alel. In večina teh bolezni.

Manj pogosti so primeri, ko količina sintetiziranega proteina postane nezadostna. V tem primeru se bo bolezen začela pojavljati tudi, če obstaja en mutantni alel in dedovanje postane prevladujoče. O takih boleznih je malo znanega, ena izmed njih je družinska hiperholesterolemija, ki jo povzroča napaka v genu receptorja LDL. Za to bolezen je značilen tudi učinek genskega odmerka, kar se kaže v dejstvu, da je družinska hiperholesterolemija pri homozigotih veliko hujša kot pri heterozigotih.

Prevladujoči tip dedovanja se kaže, ko mutantni protein ne izgubi le svoje aktivnosti, temveč tudi vpliva na delovanje normalnega alelnega produkta v heterozigotih. Ta situacija je bila vključena v literaturo, imenovano dominantno negativni učinek. Ta učinek najdemo v primeru multimernih proteinov, ki vključujejo zlasti kolagene ali dimerne transkripcijske faktorje.

MUTACIJE S PRIDOBIVANJEM FUNKCIJ

Med široko paleto funkcij za izboljšanje mutacij so z vidika klinične biokemije najbolj zanimivi primeri, ko protein pridobi novo funkcijo. Novo pridobljena funkcija se lahko pojavi na nivojih, kot je interakcija encima z novim substratom, ireverzibilna aktivacija proteina, ki prenaša signal, ali ionski kanal, prekinitev normalnega procesa inaktivacije encima, nenormalna oligomerizacija proteina ali sinteza himernega proteina.

Praznovanje Ala je dober primer pridobitve funkcije.₃₆₆-Grey v genu GNAS1, ki kodira α-podenoto heterotrimernega GTP-vezavnega proteina Gs. Ta protein združuje 7-domene receptorje za transmembranske hormone z adenilat ciklazo. Mutacija vodi do dvojne spremembe lastnosti beljakovin. Najprej se pospeši sproščanje BDP in s tem se poveča delež GTP-vezanega (aktivnega) ασ proteina, kar vodi do konstitutivne aktivacije adenilat ciklaze. Drugič, beljakovina postane termolabilna pri 37 ° C. V zvezi s tem se v vseh organih, razen v modih, aktivnost Gs zmanjša, kar vodi do razvoja dedne osteodistrofije Albright. V modih, kjer je temperatura nižja, se Gs protein nepovratno aktivira, kar vodi do testoksikoze.

Najpogostejši razlog za pridobitev funkcije je povečana ekspresija gena ali kršitev kraja ali časa njegovega izražanja, kar je najbolj značilno za maligno transformirane celice.

Za mutacije s pridobitvijo funkcije je praviloma značilen prevladujoči tip dedovanja. V redkih primerih, ko so mutacije s pridobitvijo funkcije v homozigotnem stanju, opazimo zelo hude oblike bolezni, pogosto s prenatalno smrtnostjo. Primer je homozigotna akondroplazija, najpogostejši vzrok za pritlikavost, ki jo povzročajo mutacije v genu FGFR3, ki kodira receptor za rastni faktor fibroblastov. Izbris mesta kromosoma, na katerem se nahaja FGFR3 pri drugih boleznih, ne povzroči nepravilnosti skeleta, značilnih za akondroplazijo, kar kaže na okrepitev ali pridobitev funkcije pri tej bolezni. Achondroplasia se vedno nahaja v heterozigotni obliki, saj je homozigotnost za to lastnost smrtna.

NAČELA ISKANJA MUTACIJ

Splošni pristop k iskanju mutacij v človeški genomski DNK temelji na številnih načelih.

Uporaba ene ali druge metode v diagnostiki DNK je odvisna od razpoložljivosti informacij o možnem tipu mutacije pri določenem bolniku. V primerih, ko tip mutacije ni znan, se za odkrivanje kakršnih koli razlik v nukleotidnem zaporedju mutiranih in normalnih genov uporabljajo metode presejanja. Če je mutacija znana, na primer, je bila že ugotovljena pri sorodnikih, za pregled se uporabijo drugi, enostavnejši.

in hkrati učinkovitejše metode, ki jih lahko imenujemo metode odkrivanja znanih mutacij.

Poleg tega, ne glede na usmerjenost (presejanje ali odkrivanje) izbrane metode, je treba upoštevati, da ena skupina metod temelji na specifičnosti spajanja nukleotidov pri nastajanju dvojne verige DNA, druga pa na prepoznavanju zaporedja DNA z encimi.

Za prvo skupino metod se kot referenčna sekvenca uporabijo fragmenti sekvence gena, ki se preučuje, ki ustreza divjemu tipu, t.j. najpogostejši v populaciji. To je lahko bodisi kratek oligonukleotidni začetnik (okoli 20 nukleotidov) bodisi daljši fragment DNA, uporabljen za hibridizacijo. V primeru, da bolnikova DNA vsebuje mutacijo v območju, ki ga pokriva vzorec, je popolna hibridizacija med mutiranim alelom in vzorcem nemogoča. To vodi bodisi v odsotnost produkta polimerazne verižne reakcije (PCR) bodisi v tvorbo neustreznega dupleksnega DNA, ki vsebuje neparne nukleotidne regije, ki se odkrijejo z različnimi kemijskimi ali encimatskimi metodami.

Klasičen primer metode, ki temelji na prepoznavanju zaporedij DNK z encimi, je uporaba restrikcijskih encimov, encimov, ki cepijo DNA v regijah, ki vsebujejo strogo posamezne sekvence dolžine 4-8 nukleotidov. Pojav odstopanj v nukleotidnem zaporedju kot rezultat mutacije lahko vodi do izgube že obstoječega mesta cepitve za kateri koli restrikcijski encim ali, nasprotno, njegovega videza. V isti skupini metod se uporabljajo DNA polimerazni encimi. Ti encimi sintetizirajo komplementarno verigo natančno v skladu z zaporedjem enoverižnega matriksa. Z uporabo označenih nukleotidnih blokov je mogoče določiti, v katerem zaporedju se nukleotidi nahajajo v danem matriksu. To načelo temelji na encimskem zaporedju (določanju nukleotidnega zaporedja) po metodi Sangerja, kot tudi v njegovih poenostavljenih različicah, namenjenih določanju nukleotidnega zaporedja kratkih odsekov DNA (mini sekvenciranje).

V veliki večini primerov je pred analizo lastnih mutacij raziskan fragment pacientovega genoma pomnožen s PCR. Cilj PCR je običajno preprosto množenje.

število kopij tega fragmenta, ki omogoča tehnično poznejšo analizo DNK (slika 4.3). V večini PCR variant v heterozigotih sta normalna in mutirana alela ojačena z enako učinkovitostjo in njihova diskriminacija se izvaja v naslednjih fazah. Obstaja tudi alel-specifična

Sl. 4.3. Shema verižne reakcije s polimerazo

PCR, v katerem se uporabljajo primerji, ki so homologni normalnemu ali mutantnemu alelu, ki omogoča, da se prisotnost mutacije določi že v fazi PCR s prisotnostjo ali odsotnostjo produkta pomnoževanja.

Druga univerzalna metoda, ki se pogosto uporablja za diagnosticiranje mutacij, je sekvenciranje DNA. Sekvenciranje se uporablja za iskanje neznanih mutacij in za potrditev kršitev, odkritih z drugimi metodami. Obstoječe metode omogočajo neposredno zaporedje produktov PCR, mimo kloniranja fragmenta PCR v bakterijah. Prednost zaporedja je vsestranska in zelo informativna. Glavna omejitev te metode je visoka cena, ki ne omogoča, da bi jo uporabili kot glavno pri iskanju mutacij.

Število obstoječih metod za analizo mutacij je izredno veliko, njihov opis brez pretiravanja pa zahteva ločeno knjigo. Spodaj so opisani samo tisti postopki, ki so bolje prilagojeni za uporabo v klinični praksi, tj. izpolnjujejo naslednje zahteve: zadostna občutljivost za identifikacijo mutacij, dobra ponovljivost, nizki stroški in možnost avtomatizacije.

METODE MUTACIJSKEGA PREGLEDA

Metode mutacijskega presejanja se uporabljajo v primerih, ko narava mutacije ni znana, in klinična slika dedne bolezni kaže na to, v katerih genih lahko pride do preureditve. Na primer, prisotnost tipa hiperholesterolemije IIa v kombinaciji s kantantami tetive kaže na prisotnost družinske hiperholesterolemije in kaže, da je treba mutacijo iskati v genih, povezanih z zajetjem LDL celic, predvsem v genu LDL receptorja. Ker so mutacije v tem genu z družinsko hiperholesterolemijo zelo raznolike in lahko vplivajo na celotno dolžino gena, je treba analizirati velike dele DNA. Sekvenciranje takega dolgega genskega fragmenta je predrag, zato se uporabljajo enostavnejše metode.

ANALIZA MAKROSTAVNEGA DNK BLOTTINGA

Za iskanje makroskopske DNA z uporabo Southern blotting. Pri tej metodi je genomska DNA na začetku fragmentirana z restrikcijskim encimom, po katerem nastane

DNA fragmente ločimo z gelno elektroforezo, denaturiramo in prenesemo na nitrocelulozno membrano. DNA na odtisu, dobljenem iz gela (blot), inkubiramo z označenim fragmentom proučevanega gena, ki hibridizira s tistimi fragmenti genomske DNA, ki vsebujejo gen. V prisotnosti makroskopske DNA, ki vpliva na ta gen, se niz ali velikost fragmentov, s katerimi se označeni vzorec hibridizira, razlikuje od norme.

Sl. 4.4. Heteroduplex analiza

HETERODUPLEKSNA ANALIZA Iskanje mikrodelezij / vstavkov z velikostjo manj kot 25 baznih parov kot tudi posameznih nukleotidnih substitucij je težje. Za njihovo analizo se pogosto uporabljajo posebne variante elektroforetskih metod. Ena od najpreprostejših je heterodupleksna analiza (slika 4.4). Pri tej metodi se vzorec, ki vsebuje mešanico normalnega (referenčnega) in pomnoženega fragmenta DNA, ki se preiskuje, segreje, da se denaturira DNA, in nato ohladi z obnovo strukture z dvojno verigo DNA. Ker prisotnost majhnih razlik v nukleotidnem zaporedju ne preprečuje hibridizacije, je del dobljenih dupleksov sestavljen iz referenčne in testirane DNA. Na referenčnih in testnih DNK, ki se razlikujejo po sestavi nukleotidov, je normalno združevanje nukleotidov nemogoče in nastane tako imenovana neusklajenost. Dvojno verižna DNA, ki ima neskladje v svoji strukturi, na elektroforezi migrira drugače kot popolnoma dopolnilni duplex, kar omogoča odkrivanje nenormalno migracijskih fragmentov po obarvanju DNA.

ANALIZA POLIMORFIZMA USKLAJEVANJA ENOTNE DNK

Druga priljubljena elektroforetska metoda mutacijskega pregledovanja je konformacijski polimorfizem konformacijskega polimorfizma (SSCP) z enim pramenom. Načelo metode temelji na dejstvu, da če se denaturirana s segrevanjem DNK ostro ohladi, se ne tvorijo večinoma dvojne verige, ampak kratke dvoverižne regije znotraj vsakega enoverižnega fragmenta DNA (sl. 4.5). Običajno nastane več relativno stabilnih variant, ki se zaradi različne prostorske konformacije na različne načine migrirajo na elektroforezo. Področja komplementarnosti znotraj roka so ponavadi kratka in vsaka sprememba, ki je posledica celo ene nukleotidne substitucije, ponavadi vodi do izginotja te oblike intrakainskega dupleksa. Posledica tega je, da se na elektroflogramu spremenita porazdelitev in intenzivnost enoverižnih DNA pasov. Ta metoda ne pove ničesar o naravi razlik v nukleotidnem zaporedju, zato je treba nenormalne vzorce sekvencirati.

Sl. 4.5. Analiza polimorfizma konformacije enoverižne DNA

ELEKTROPHORESA ARHITEKTURE DNK AT DENATURANTNA GRADIENTA Elektroforetska analiza DNA v denaturantnem gradientu je bolj električno ponovljiva in informativna kot SSCP (sl. 4.6). Očitno je, da bo vsaka nukleotidna substitucija povzročila spremembo jakosti DNK dupleksa in bo denaturirala v enojne verige pri nenormalni temperaturi ali koncentraciji denaturacijskega sredstva v primerjavi z normalnim zaporedjem. Pri tej metodi izvajamo elektroforezo v poliakrilamidnih gelih, ki vsebujejo višjo koncentracijo denaturanta v spodnjem delu kot v zgornjem delu. Med elektroforezo se normalni in mutirani fragmenti DNA denaturirajo v različnih delih gela. Ker je mobilnost nastalih enojnih verig veliko nižja,

Sl. 4.6. Elektroforeza v gradientu denaturanta

kot dvoverižna DNA (zaradi konformacijskih značilnosti enoverižne DNA), denaturirani fragment močno upočasni migracijo, medtem ko se dvojna veriga še naprej premika. Kot rezultat, normalni in mutirani fragmenti DNA migrirajo na različnih razdaljah v gelu. Včasih kot denaturant uporabimo ne kemično snov, temveč temperaturni gradient.

DENATURING FIEL-EFFICIENT LIQUID

KROMATOGRAFIJA Razlike v jakosti normalnih in mutantnih dupleksov je mogoče zaznati tudi z denaturirsko tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Pri tej metodi je fragment DNA, podobno kot zgoraj opisane elektroforetske metode, izpostavljen gradientu denaturacijskih sredstev, vendar se DNA analiza izvede s kromatografsko metodo s spektrofotometrično detekcijo. Ta metoda je zelo občutljiva in enostavna za avtomatizacijo, zato se vedno bolj uporablja za klinično diagnostiko DNK.

KEMIJSKA DETEKCIJA NEUPAKTIRANEGA NUKLEOTIDA Druga skupina metod temelji na odkrivanju mutacij z uporabo encimov ali kemične obdelave, ki specifično uničuje območja ne-komplementarnega parjenja.

Analizirani fragment DNA je denaturiran, zmešan s kontrolnim vzorcem, ki vsebuje normalno DNA, in ohlajen, da se tvorijo dupleksi, od katerih bodo nekateri, če ima pacient mutacije, vsebovali območja brez para. Obdelava DNA heterodupleksa s hidroksilaminom ali osmijevim tetroksidom vodi do modifikacije neparnih nukleotidov, ki vsebujejo citozin in timidin. Nadaljnje zdravljenje s piperidinom vodi do cepitve DNA na nukleotidu. Posledično se v normalnih vzorcih ohrani velikost DNA, mutantne pa vsebujejo niz fragmentov, ki ustrezajo mutacijam, ki vplivajo na nukleotide C ali T. Ta metoda ni široko uporabljena, verjetno zaradi visoke toksičnosti uporabljenih reagentov.

VAROVANJE PROTI RNKAZY Pri drugi metodi se ugotovi prisotnost neparnih nukleotidov z uporabo encima RNaza. Ta metoda uporablja označeno sondo RNA, ki ustreza normalni sekvenci genov, ki se hibridizira s proučevanim fragmentom DNA (slika 4.7). Kot del dupleksa DNA / RNA je RNA odporna na RNazo, zato se ta metoda imenuje zaščita proti RNazi. Vendar pa v regijah, ki so različna v nukleotidnem zaporedju med vzorcem in vzorcem, ki ga je treba analizirati, ne pride do združevanja nukleotidov. Nastanek fragmentov RNA se zabeleži z elektroforezo. Ta metoda je ena izmed najbolj občutljivih mutacij, specifičnih za presejanje, vendar ni bila široko uporabljena, očitno zaradi neprijetnosti dela z labilnimi sondami RNA. Obstajajo druge metode, ki temeljijo na prepoznavanju encimov za neparne baze; ni jasno, kako široko se bodo uporabljali v klinični diagnozi.

PREGLED DIAGNOSTIČNIH MUTACIJ Elektroforetske metode mutacijskega presejanja so ne-absolutne občutljivosti, običajno zaznavajo le približno polovico mutacij in polimorfizmov v analiziranih fragmentih in le občutljivost denaturacije.

elektroforeza se približuje 100%. V kombinaciji z razmeroma nizkimi stroški in možnostjo avtomatizacije je ta metoda vedno bolj priljubljena.

Druga značilnost presejalnih metod je, da je s pozitivnimi rezultati potrebna dodatna sekvenciranje ali analiza omejevalnih encimov, ker presejalne metode niso

Sl. 4.7. Metoda zaščite RNase

podati vse informacije o naravi nukleotidnih razlik. Pri izvajanju DNK diagnostike ni dovolj zaznati odklon nukleotidnega zaporedja pri pacientu, kar vodi do zamenjave kodirane aminokisline. Treba je potrditi, da je ta aminokislinska substitucija funkcionalno pomembna. Neposredna metoda je pridobivanje rekombinantnega mutantnega proteina in določanje njegove aktivnosti. Ta dolgotrajen in drag pristop se v glavnem uporablja za raziskovalne namene. V praksi jih pogosteje vodi vrsta aminokislinske substitucije. V primeru, ko normalne in mutantne aminokisline pripadajo različnim strukturnim razredom, je verjetnost funkcionalnih sprememb v proteinu višja. Verjetnost disfunkcije proteina je še višja, če mutacija vpliva na evolucijsko ohranjene dele gena, t.j. tiste določbe, v katerih je ista aminokislina prisotna v več sesalskih vrstah. Prisotnost takih lokacij običajno vpliva na sintezo, transport ali delovanje beljakovin in vsaka sprememba v njih vpliva na aktivnost proteina. Na primer, analiza sekvence gena LDL receptorja kitajskega hrčka, zajca, podgane, miši in Xenopus laevis je pokazala 81, 79, 77, 76 in 70% homologijo humanega receptorja. Baza podatkov UMD-LDLR, ki je dostopna prek interneta, vsebuje številne programe za analizo mutacij v genu receptorja LDL, vključno z možnostjo analize konservativnosti vsakega segmenta gena.

Dodatne informacije o patogenosti mutacije lahko dobite s pregledom sorodnikov bolnika. V primeru, da je ista mutacija prisotna pri sorodnikih bolnika z znaki te bolezni (npr. Zvišana raven holesterola v družinski hiperholesterolemiji), vendar je pri zdravih posameznikih odsotna (več kot 100 darovalcev se običajno pregleda brez znakov te bolezni), je verjetnost, da Ta mutacija je patogena, zelo visoka.

Na splošno je kljub ne-absolutni občutljivosti metod mutacije mutacije razmerje med vsebino informacij in stroški teh metod precej visoko in se v praksi pogosto uporabljajo. Vendar je treba upoštevati, da je njihova negativna napovedna moč majhna. Z drugimi besedami, odsotnost kakršnih koli značilnosti vzorca DNK, kadar se analizira z metodami presejanja, ne pomeni, da ta DNA ne vsebuje mutacij.

METODE ODKRIVANJA MUTACIJ

V primeru, ko so znane možne variante genetskih prerazporeditev in jih ni veliko, lahko uporabite metode, ki so hitrejše in cenejše od metod mutacijskega presejanja. Te metode temeljijo na DNA hibridizaciji ali na sposobnosti restrikcijskih encimov, da prepoznajo dobro definirane nukleotidne sekvence ali DNA polimeraze za sintezo DNA, ki je komplementarna matriksu (mini-sekvenciranje).

Sl. 4.8. Analiza omejitev

ANALIZA OMEJITVE Najpreprostejša metoda za odkrivanje mutacij je omejevalna analiza (slika 4.8). Osnova te metode je zelo visoka specifičnost restrikcijskih endonukleaz glede na določene nukleotidne sekvence. Vsak od teh bakterijskih encimov prepozna strogo individualno zaporedje 4-8 nukleotidov in reže dvojno verigo DNK znotraj ali v bližini tega mesta. Dovolj je, da zamenjamo en nukleotid, da bi kršili omejitev tega encima. V primerih, ko je polimorfni nukleotid del restrikcijskega mesta, se lahko genotipizira s 100% zanesljivostjo z uporabo restrikcijskega encima. Nukleotidne substitucije najpogosteje kršijo obstoječa omejevalna mesta, včasih pa ustvarjajo nova mesta. Pomanjkljivost metode je v tem, da polimorfni nukleotidi niso vedno v prepoznavnih mestih katerekoli restrikcije. Delna rešitev je možna v primerih, kjer območje, v katerem se nahaja mutacija, vsebuje vsaj nekaj nukleotidov, ki sestavljajo restrikcijsko mesto. Med PCR je lahko umetno ustvarjeno popolno restrikcijsko mesto. Za to uporabimo primerje, ki ne ustrezajo popolnoma zaporedju nukleotidov na področju mutacije, vendar vsebujejo 1-2 ne-komplementarnih nukleotidov, ki dopolnjujejo restrikcijsko mesto, ki bo vključevala polimorfni nukleotid. Običajno je uvedba majhnega števila ne-komplementarnih baz nekoliko zmanjšala učinkovitost PCR, zato se po pomnoževanju pojavi novo restrikcijsko mesto v produktu, v katerega je vključen tudi polimorfni nukleotid. Nadaljnje restrikcijske analize se izvajajo na enak način kot pri standardni metodi.

ALLELSPECIFIC PCR V nekaterih primerih lahko PCR uporabimo, da ne obogatimo proučevanega fragmenta genomske DNA, ampak neposredno odkrijemo mutacijo (sl. 4.9). V tej izvedbi se eden izmed primerjev hibridizira z regijo DNA, v kateri se nahaja polimorfni nukleotid. Temperatura žarjenja začetnih oligonukleotidov je izbrana tako, da se vezava primerja in naknadno pomnoževanje odvija le s popolnim sovpadanjem DNA in primernih sekvenc. Na primer, ko se primer, ki ustreza mutantnemu zaporedju, veže na normalno DNA, se tvori neparni nukleotid, ki zmanjša jakost vezave temeljnega na DNA. Pri dovolj visoki temperaturi žarjenja

Sl. 4.9. Allele-specifična verižna reakcija polimeraze

na splošno preneha vezati na normalen alel, PCR se ne nadaljuje in izdelek se ne kopiči. Običajno je vzporedna reakcija s primerjem, ki ustreza normalnemu alelu. Ta reakcija služi kot pozitivna kontrola, ki kaže normalen potek pomnoževanja. Ker lahko prisotnost ene neskladnosti rahlo zmanjša moč vezave primerja na DNA, se včasih v začetno zaporedje vnese drugo neusklajenost, da se dodatno destabilizira duplex in zmanjša donos produkta v prisotnosti neparnega nukleotida v polimorfni regiji.

PCR R REAL REMAINS

Prednost zgoraj opisanega alel-specifičnega postopka PCR je zmanjšanje števila stopenj v postopku analize, saj ne zahteva obdelave produkta z restrikcijami ali uporabe kompleksnih elektroforetskih metod.

Še več, metoda se pospešuje z uporabo PCR v realnem času (RT-PCR). Pri tej metodi se tvorba produkta ne spremlja z elektroforezo, kot pri standardni PCR metodi, ampak neposredno med PCR za akumulacijo dvojne verige DNA v reakcijskem mediju. Akumulacijo DNA določimo po vsakem polimerizacijskem ciklu s povečanjem fluorescence SYBR Green barve ali njenih analogov, katerih fluorescenca se dramatično poveča pri interakciji z dvoverižno DNA, vendar ni odvisna od prisotnosti nukleotidov ali primerjev. Instrumenti za RT-PCR so kombinacija PCR ojačevalnika in fluorimetra. Ko je pomnoževanje končano, lahko specifičnost pridobljenega izdelka določimo z merjenjem tališča, ki ga spremljamo, da zmanjšamo fluorescenco SYBR Green.

TESTIRANJE TAQMAN Obstajajo tudi drugi načini za registracijo produkta PCR neposredno v reakcijski zmesi brez elektroforeze. Metoda, patentirana s strani Hofmann LaRoche, temelji na detekciji pomnožene DNA z uporabo oligonukleotidne sonde, ki hibridizira z osrednjim delom pomnožene sekvence. Na koncih vzorcev oligonukleotidov, imenovanih TaqMan, so nukleotidi označeni z dvema različnima fluorescentnima barvama, od katerih ena zavira fluorescenco drugega. Kot posledica gašenja je raven fluorescence drugega barvila majhna. Taq polimeraza, ki dopolni novo verigo iz ene od začetnih oligonukleotidov, razdeli vzorec TaqMan, ki se veže na sredino območja amplificirane DNA, zaradi njegove eksonukleazne aktivnosti, zaradi česar se fluorescentno označeni nukleotidi sproščajo v raztopino in učinek gašenja izgine, ker se opazuje samo v ko se fluorofori nahajajo blizu drug drugega. Posledica tega je, da se fluorescenca barve poveča, več oligonukleotidnih vzorcev uniči DNA polimeraza med pomnoževanjem, t.j. več izdelka se oblikuje. Ta metoda se uporablja tudi za analizo mutacij. Za to uporabimo dva vzorca TaqMan, označena z različnimi pari fluoroforjev in se razlikujeta v nukleotidnem zaporedju v polimorfnem območju, od katerih eden ustreza divjemu tipu, drugi pa mutantnemu. Razgradnja vzorca polimeraze DNA

Sl. 4.10. TaqMan sonde. P - reportersko barvilo, T - dušilec fluorescence

izvedemo pri temperaturi, pri kateri se med analiziranim fragmentom in vzorci shranjujejo samo popolnoma komplementarni kompleksi. S povečanjem fluorescence barvil, ki tvorijo normalni ali mutantni vzorec, je mogoče določiti, katere različice so prisotne v analiziranem vzorcu. Ta metoda omogoča zanesljivo razlikovanje med hetero- in homozigotnimi nosilci mutacij.

Molekularne peči Druga metoda odkrivanja mutacij, ki temelji na učinku gašenja fluorescence, se izvaja v metodi molekularnih signalov (slika 4.11). Oligonukleotid se imenuje boja, 3'- in 5'-konci, ki so označeni z dvema barvili, od katerih ena deluje kot dušilno sredstvo. Za razliko od vzorcev TaqMan so boje daljše in vsebujejo blizu koncev kratkih komplementarnih delov drug drugega, ki se pri navadni temperaturi medsebojno žarijo, da tvorijo ostrino. V tem primeru se barve, ki se nahajajo na koncih oligonukleotida, približujejo drug drugemu in fluorescenco ene barve pogasimo z drugo. Na sredini boja nukleotidna sekvenca ustreza preučevani regiji DNA. Po denaturaciji s segrevanjem, ki vodi do taljenja ostrega dela, se mešanica DNK z bojami ohladi, kar omogoča tvorbo dupleksa boje z analizirano DNK. Po nadaljnjem hlajenju se zatiči ponovno oblikujejo v prostih bojah in fluorescenca se zmanjša. V nasprotju s tem pa so v svetilniki, povezani z analizirano DNA,

Sl. 4.11. Metoda molekularnih znakov. P - reportersko barvilo, T - dušilec fluorescence

barve ostanejo oddaljene druga od druge in njihova fluorescenca ostaja visoka. Hibridizacija testne DNA z vedri, ki vsebujejo normalno ali mutantno nukleotidno zaporedje v osrednjem delu, omogoča določanje genotipa testne DNA.

HIBRIDIZACIJA Z VSEH POSEBNIH

Ta metoda temelji na hibridizaciji testne DNA z oligonukleotidi, ki so homologni mestu mutacije in okoliški sekvenci. Ta metoda obstaja v dveh oblikah. Včasih je PCR produkt imobiliziran na trdni osnovi in v raztopino dodamo označene oligonukleotide. Pogoji pranja so izbrani tako, da se uničijo dupleksi, ki vsebujejo neparne baze. Posledično ostanejo na matriki samo oligonukleotidi, ki so 100% komplementarni analizirani DNA. Z dodajanjem oligonukleotidov, ki ustrezajo zaporedju normalni ali mutantni varianti, je mogoče določiti, kateri nukleotid je prisoten v analizirani DNA. V drugi varianti te metode so oligonukleotidi imobilizirani na matrici, s katero se hibridizira označeni produkt PCR.

Prednost metode hibridizacije z oligonukleotidi je možnost njegove miniaturizacije, ko je širok nabor oligonukleotidov imobiliziran na mikročipu, kar omogoča hkratno zaznavanje številnih mutacij. Glavna težava te metode je potreba po strogem izboru pogojev za hibridizacijo in izpiranje nepopolno komplementarne DNA. Ni jasno, kako široko bo ta metoda uporabljena v praktični diagnostiki DNK.

VSE POSEBNA REAGACIJA LIGAZE Učinkovita metoda za odkrivanje enonukleotidnih substitucij in kratkih prerazporeditev je ligazna reakcija (slika 4.12). Analizirana DNA hibridizira z dvema oligonukleotidoma, od katerih se eden konča z nukleotidom, komplementarnim polimorfnemu mestu, drugi pa neposredno s tem. Po koncu hibridizacije encimska DNA ligaza povezuje oligonukleotide in tvori daljši fragment, ki se močno razlikuje od originalnih oligonukleotidov v mobilnosti.

Sl. 4.12. Alelna specifična ligazna reakcija

z elektroforezo. Če oligonukleotidi niso popolnoma komplementarni z fragmentom DNA in se po hibridizaciji v polimorfnem območju oblikujejo neparni nukleotidi, ligaza ne premosti takih oligonukleotidov in dolg fragment ni oblikovan. Tako lahko z izvajanjem ligazne reakcije z enim skupnim in enim od dveh alel specifičnih vzorcev genotipiziramo vzorec DNK za dani nukleotid.

Pri tej metodi je PCR produkt hibridiziran z vezavo oligonukleotida na b'-strani mesta polimorfizma (slika 4.13). Po hibridizaciji v reakcijsko zmes dodamo DNA polimerazo in enega od štirih modificiranih nukleotidov. V tej reakciji uporabimo fluorescentno označene dideoksinukleotide, zaradi česar lahko DNA polimeraza dopolni samo en nukleotid, ki je komplementaran s tistim, ki se nahaja v analiziranem položaju. Zato bo reakcija potekala samo v cevi, kjer je dodan nukleotid, ki dopolnjuje analizirano. V nekaterih primerih so vsi štirje nukleotidi prisotni v reakcijski zmesi, vendar označeni z različnimi barvili. Analiza fluorescence na štirih valovnih dolžinah vam omogoča, da določite, kateri nukleotid se aktivira in je zato analiziran nukleotid komplementaran. Ker ta metoda uporablja isto načelo kot pri encimskem sekvenciranju DNA, se pogosto imenuje mini sekvenciranje.

Obstajajo tudi druge metode za določanje mutacij, ki temeljijo na aktivnosti DNA polimeraze. V enem izmed njih, imenovanem pirosekvenciranje, je vsak korak podaljšanja verige DNA polimeraze zabeležen z nastajanjem pirofosfata, ki se spremlja z uporabo konjugiranih encimskih reakcij, kar povzroči izbruh kemiluminescence kot odziv na tvorbo pirofosfata (slika 4.14). Ta metoda omogoča zaporedje le zelo kratkih delov DNK, zato je njegova glavna uporaba analiza mutacij. Nukleotid, ki ga je treba analizirati, se identificira z dodatkom katerega od štirih nukleotidov (konvencionalni nukleotidi, ki se uporabljajo v tej metodi) povzročijo izbruh kemiluminescence.

Sl. 4.13. Mini sekvenciranje

Sl. 4.14. Načelo sekvenciranja DNA

DETEKCIJA MUTACIJE G DIAGNOSTIKA Ko se pravilno uporabljajo, metode odkrivanja določajo prisotnost ali odsotnost mutacij z zelo visoko občutljivostjo in specifičnostjo, kar omogoča, da se informacije, pridobljene s temi metodami, uporabijo za zelo pomembne odločitve, kot je potreba po splavu med prenatalno diagnozo.

Za prenatalno diagnostiko obstajata dve metodi. Amniocenteza je sestavljena iz izbire približno 10 ml amnijske tekočine skozi trebušno steno (slika 4.15). Optimalen izraz

Sl. 4.15. Amniocenteza

izvajanje - 16. teden nosečnosti. Fetalne celice izoliramo iz tekočine s centrifugiranjem in bodisi takoj analiziramo s PCR ali postavimo v kulturo. Celice v kulturi se delijo in po določenem času zadostujejo za izvedbo kromosomske analize, kasneje pa tudi biokemične. Druga metoda, biopsija horionske vilice, je možna v zgodnjih fazah nosečnosti, v 10. do 12. tednu (sl. 4.16). Ta postopek je sestavljen iz transabdominalne ali transcervikalne biopsije horionskih resic. Če so za analizo DNK dovolj materiala, lahko takoj gojimo ali analiziramo celice horiona. Če se odkrijejo kromosomske nepravilnosti ali mutacije, lahko nosečnost prekineta starša.

Izvajanje prenatalne diagnostike mutacij je smiselno, če obstaja zanesljiva metoda za odkrivanje mutacije, ki je prisotna v določeni družini. V nekaterih primerih se lahko določi

Sl. 4.16. Chorionska biopsija

ali je zarodek podedoval dedno bolezen, ne da bi vedel natančno lokacijo mutacije, ampak se je zanašal na analizo genetske povezave bolezni v družini. Vendar to ni vedno mogoče, saj so za analizo povezave potrebne vzorci DNK več bolnih sorodnikov in veliko število zdravih družinskih članov.

4.5.2. ZNAČILNOSTI UPORABE DNK DIAGNOSTIKE

Najvišjo diagnostično vrednost genetskega testiranja opazimo v primerih, ko obstaja visoka korelacija med prisotnostjo genetske okvare in verjetnostjo razvoja patologije, to je za bolezni z visoko penetracijo.

Takšne bolezni doživljajo stalni pritisk naravne selekcije, zaradi česar je njihova pogostnost v splošni populaciji običajno majhna. V zvezi s tem je večina uporabljenih genetskih testov povezana z diagnozo redkih oblik bolezni. Tudi najpogostejše oblike človeških monogenskih bolezni, opisane v nadaljevanju, se klinično manifestirajo ne pogosteje kot pri eni osebi od več sto.

Pogoste človeške bolezni, kot so hipertenzija, sladkorna bolezen, bolezni srca in ožilja, čeprav so odvisne od genetskih dejavnikov, imajo nizko penetracijo, kompleksnost, spremenljivo in slabo preučeno genetsko strukturo, zato kljub očitni potrebi po iskanju genetske predispozicije za pogoste bolezni raziskave v praksi zelo omejene.

FAKTORJI UČINKOVITOSTI Razmerje med informativnostjo rezultatov DNK diagnostike in stroški njegovega izvajanja je v veliki meri odvisno od genetske kompleksnosti bolezni. Primeri vključujejo hemokromatozo, pri kateri dve mutaciji povzročata skoraj vse klinične primere med belo populacijo in družinsko hiperholesterolemijo, ki jo lahko povzroči več kot 800 mutacij v genu za receptor LDL, od katerih nobena ni pogostejša kot pri 1% bolnikov z družinska hiperholesterolemija. Večina dednih bolezni je v tem razponu vmesna, približuje se družinski hiperholesterolemiji, kadar lahko stroški diagnosticiranja DNK omejijo njeno izvajanje.

Pod določenimi pogoji se lahko zmanjša kompleksnost diagnoze in s tem tudi njena cena. To je mogoče pri populacijah, pri katerih je genetska struktura bolezni enostavnejša kot v drugih populacijah. Ta učinek je najbolj izrazit pri populacijah s tako imenovanim učinkom ustanovitelja. Ta genetski izraz pomeni, da je pomemben del prebivalstva podedoval določeno mutacijo enega od svojih prednikov. Zaradi tega povsem naključnega dogodka v tej populaciji večina primerov te bolezni povzroča ta mutacija. Tipičen primer genetskega testiranja je populacija afrikanov, prebivalcev južne Afrike severnoevropskega izvora. Sodobni afrikanci so potomci majhnega števila družin iz Nizozemske, ki so se preselile v Afriko v 17.-18. Stoletju. Med afrikanerji je družinska hiperholesterolemija, ki vodi v zgodnji razvoj koronarne arterijske bolezni, večkrat pogostejša kot v evropski ali ameriški populaciji. Poleg tega je velika večina (> 95%) primerov družinske hiperholesterolemije v beli populaciji Južne Afrike posledica prisotnosti ene od treh mutacij v LDL receptorju. Takšna genetska homogenost močno nasprotuje genetski strukturi družinske hiperholesterolemije v drugih državah, kjer je opisanih na stotine mutacij, od katerih nobena ni pogostejša kot pri 1-2% bolnikov. Očitno je, da je več priseljenskih družin (vsaj tri) imelo mutacije, ki se zdaj imenujejo afrikanerskimi, ki so postale glavni vzrok za družinsko hiperholesterolemijo pri njihovih potomcih. Z vidika praktične medicine je molekularno genetsko testiranje belcev v Južni Afriki zaradi prisotnosti družinske hiperholesterolemije dokaj učinkovit in relativno poceni pristop, ki omogoča presimptomatsko diagnozo te bolezni. Za razliko od Južne Afrike druge države potrebujejo veliko dražji arzenal molekularnih metod, ki bi postavile takšno diagnozo.

Za druge dedne bolezni obstaja tudi razlika v pogostnosti mutacij med populacijami. Na primer, misense mutacija cis₂₈₂

Pnevmatika v genu HFE, ki vodi do razvoja hemokromatoze, je precej pogosta pri evropskih populacijah, kjer je pogostnost njenih nosilcev do 10-15%. Nasprotno pa so v afriških, azijskih in avstralskih aboriginalnih populacijah

Ta mutacija je zelo redka. Domnevamo, da je mutacija Cis₂₈₂-Pnevmatike so nastale v Evropi pred približno 2000 leti.

Poleg učinka ustanovitelja je drugi biološki mehanizem, ki poenostavlja iskanje mutacij celo v gensko odprti populaciji, prisotnost vročih točk mutacij v genih. Dokazano je, da se verjetnost pojava mutacij razlikuje v območjih genoma z različno vsebnostjo GC-nukleotidov. Znano je tudi zaporedje, v katerem se DNA polimeraza a ustavi; v takih regijah se pogosto pojavljajo sporadične delecije v različnih genih. Zaradi teh dejavnikov mutacije niso enakomerno porazdeljene po dolžini gena, ampak so koncentrirane na določenih področjih, kar poenostavlja njihovo iskanje.

Zato so za učinkovito diagnosticiranje DNK potrebne informacije o najpogostejših mutacijah, ki vodijo v razvoj te bolezni v populaciji, ki ji bolnik pripada.

DEJAVNIKI DIAGNOSTIČNE VREDNOSTI

Pri številnih dednih presnovnih motnjah je prisotnost bolezni mogoče sumiti med biokemijsko analizo. Na primer, bolniki z družinsko hiperholesterolemijo imajo običajno povišane ravni LDL holesterola, pri hemokromatozi pa se poveča nasičenost transferina z železom. Biokemični parametri so odvisni od variabilnosti vsakega posameznika. Posledica tega je, da se posameznikom, na primer s povišanimi vrednostmi LDL holesterola, priporoča, da ponovijo teste s presledkom 3 mesecev, da se prepričate, da je odkrito presnovno odstopanje zanesljivo. V nekaterih primerih so biokemični indikatorji v tako imenovani sivi coni, kar dodatno oteži diagnozo. Tu lahko pomaga DNK diagnostika. Prisotnost mutacije kaže na povprečno predispozicijo skozi celo življenje, da se ta biokemični parameter spremeni v patološko, tako rekoč, patološko pripravljenost. V nasprotju z biokemičnim fenotipom genotip ni podvržen individualnim in populacijskim variacijam, ki so značilne za biokemične parametre. Tako DNK diagnostika omogoča potrditev biokemične diagnoze z neodvisno metodo, kot tudi izključitev prisotnosti drugih vzrokov za to biokemično motnjo. Očitno je, da je maksimalna informativnost DNK diagnoze dednih presnovnih motenj dosežena, ko se kombinira s klasičnimi biokemičnimi metodami.

Pri razpravljanju o specifičnosti in občutljivosti metod za diagnosticiranje DNK je treba najprej ugotoviti, kaj je na kocki - določitev specifične mutacije ali iskanje neznane genetske motnje pri pacientu. V primeru specifične mutacije, za katero so bile razvite zanesljive metode odkrivanja, so občutljivost in specifičnost detekcije blizu 100%. Za določitev diagnostične vrednosti celotnega molekularno genetskega testa je treba upoštevati občutljivost odkrivanja mutacij v kombinaciji z njihovo penetracijo.

Pozitivna diagnostična vrednost testa je v veliki meri odvisna od penetracije mutacij. Na primer, odkrivanje trisomije na kromosomu 21 ali mutacije, specifične za Duchennovo mišično distrofijo ali Huntingtonovo bolezen, kaže, da imajo ti posamezniki z verjetnostjo blizu 100% nadaljnji razvoj ali ustrezen klinični sindrom. Vendar pa tako visoka pozitivna diagnostična vrednost ni tipična za vse genetske teste. Pri mutacijah z nizko penetracijo, na primer pri nosilcih mutacij s hemokromatozo, verjetnost za razvoj kliničnih manifestacij ne presega nekaj odstotkov. V takih primerih odkrivanje napake kaže le na nagnjenost k razvoju te bolezni, ki je močno odvisna od prisotnosti dodatnih dednih dejavnikov in okoljskih dejavnikov.

Enostavnejša in bolj proučena genetska struktura te bolezni, lažje je zaznati mutacijo in večja je občutljivost testa. Na žalost je velika večina genetskih bolezni posledica številnih mutacij, ki se pogosto nahajajo v različnih genih. V kombinaciji z omejenimi zmogljivostmi sodobnih molekularnih metod to zmanjšuje občutljivost molekularno genetskega testiranja. Na primer, zdaj tudi v najboljših molekularno-genetskih laboratorijih, ki delajo z bolniki s družinsko hiperholesterolemijo, lahko mutacije zaznajo le pri polovici bolnikov s potrjeno klinično diagnozo. Drug primer je Duhenenova miodistrofija. V tem primeru se lahko delijska bolezen v genu za distrofin odkrije le v 70% primerov, preostali bolniki pa potrebujejo dodatno histološko analizo mišične biopsije. V primerih, ko test ne more odkriti vseh genetskih sprememb, ki vodijo do bolezni, je njena negativna napovedna moč majhna.

V določenih situacijah je lahko negativna napovedna moč testov DNK zelo visoka. Govorimo o prenatalni in presimptomatski diagnostiki v primerih, ko so znane patogene mutacije, ki so prisotne pri starših. V takšni situaciji visoka natančnost molekularnih metod omogoča z dovolj zanesljivosti, da pokaže ne le prisotnost, ampak tudi odsotnost starševskih mutacij pri plodu ali otroku.

Če povzamemo, lahko rečemo, da ima večina molekularno genetskih testov pomembno pozitivno napovedno moč, zaradi česar jih je priporočljivo uporabljati v kliniki, zlasti v primeru visoke penetracije in patogenosti mutacij. Nasprotno pa je negativna napovedna moč večine molekularnih testov majhna, razen če je znano, katere mutacije so bile pri starših.

4.5.3. PRIMERI UPORABE DNK DIAGNOSTIKE V KLINIKI

Kot je znano, klasična medicinska genetika opisuje monogene visoko penetrantne in klinično resne bolezni. Pogostost takih bolezni običajno ne presega 1 na 5000 prebivalcev. Pri analizi DNK lahko odkrijemo približno tisoč monogenih dednih bolezni. Seznam testov in laboratorijev, ki jih izvajajo, se nenehno posodablja na internetu (http://www.geneclinics.org). Večina DNK diagnostike se zdaj uporablja v genetskem svetovanju in prenatalni diagnozi, da bi preprečili rojstvo otrok s patologijo.

Poleg klasičnih monogenskih primerov pa se v kliniki pogosto pojavljajo dedne bolezni, za katere je značilna razmeroma nizka penetracija in sorazmerno blag potek. Tradicionalno so jih pripisovali monogenskemu, vendar pa zbrani podatki v zadnjem času kažejo na več oligogenske narave teh bolezni.

V nadaljevanju je podrobna razprava o nekaj skupnih človeških oligogenih boleznih, kot so hemokromatoza, dedna trombofilija, družinska hiperholesterolemija, cistična fibroza in hipertrofična kardiomiopatija. Heterozigotni nosilci mutacij, ki vodijo do teh bolezni, se pojavljajo v populaciji s pogostnostjo 1 od 500 do 1 od 20 ljudi. Zaradi visoke populacijske pogostnosti bolezni v tej skupini je pomembna

skupni prispevek k človeški patologiji, ki verjetno presega prispevek redkih dednih bolezni. Pri vseh teh boleznih DNK test omogoča presimptomatsko diagnozo in za hemokromatozo, trombofilijo in hiperholesterolemijo ter kasnejšo profilakso, farmakološko in s spremembo načina življenja.

To je eden najpogostejših genetskih presnovnih motenj, ki se imenujejo prirojene presnovne napake, in se pojavlja pri 1 od 200 do 300 ljudi v severni Evropi.

Klasična triada - sladkorna bolezen, ciroza in pigmentacija kože (»bronasta diabetes«) - je bila opisana že leta 1865, leta 1935 pa je bila dokazana družinska narava te bolezni. Osnova za klinične manifestacije GC je biokemična napaka - prekomerno kopičenje železa v parenhimskih celicah jeter, trebušne slinavke, srca in sprednje hipofize. Da bi preprečili razvoj kliničnih manifestacij, lahko uporabite zelo preprost in hkrati učinkovit način - preventivno flebotomijo. Vmesni GC fenotip je povišana raven železa v plazmi in jetrih, kar se ocenjuje z različnimi biokemičnimi testi, kot je nasičenost s transferinom z železom, koncentracija feritina in vsebnost železa v jetrih.

Klinične manifestacije GC so zelo različne. Ena najpogostejših pojavov je kronična poškodba jetrnega parenhima. Značilna značilnost je splošna ali lokalna okrepitev pigmentacije kože. Pri 30-60% bolnikov z napredovalo boleznijo je sladkorna bolezen. V zgodnjih fazah GC se kažejo nespecifični simptomi, kot so letargija, hepatomegalija, artropatija, kardiomiopatija, diabetes, hiperpigmentacija kože ali hipogonadizem. Klinične manifestacije so odvisne od genetskih in zunanjih dejavnikov, kot so vsebnost železa v prehrani, darovanje krvi in fiziološka izguba krvi pri ženskah med menstruacijo.

Leta 1996 je bil identificiran gen, ki je bil odgovoren za najpogostejšo obliko GC, ki se je imenovala HFE. Ta gen kodira transmembranski protein, ki sestoji iz kratke citoplazmatske domene, transmembranske regije in treh zunajceličnih domen, ki interagirajo z β₂-mikroglobulina na celični površini. Protein HFE se na površini enterocita veže na receptor transferina in zmanjšuje afiniteto za prenašanje transferina

železo V odsotnosti funkcionalno aktivnega HFE se poveča vezava in kasnejša endocitoza transferina, kar vodi do kopičenja železa v celici, kjer se shranjuje kot kompleks s feritinom. Med bolniki keltskega izvora s klinično hudim GC je približno 90% homozigotnih za mutacijo Cis₂₈₂-Pnevmatika v genu HFE in večina preostalih ima kombinacijo Cys₂₈₂-Tyr in še ena mutacija - GiS_bz-Asp. Kot posledica mutacije Cis₂₈₂-Tyr moti nastajanje disulfidne vezi v eni od zunajceličnih domen HFE proteina, njegova konformacija je motena in protein ostaja po sintezi v endoplazmatskem retikulumu. Posledica tega je, da se beljakovina preneha izražati na površini celice, kar vodi do povečanega zajetja železa, ki je neustrezno za potrebe organizma. Pri večini populacij kavkaza je pogostnost heterozigotnih nosilcev alela Cis₂₈₂-Razpon je približno 10%, za baske in irske ljudi keltskega izvora pa lahko pogostost tega polimorfizma doseže 30%. Za razliko od Evropejcev se ta mutacija skoraj nikoli ne najde v mongoloidih in negroidih. Domnevamo, da je mutacija Cis₂₈₂-Pnevmatika je nastala pred približno 2000 leti v keltski populaciji in se razširila po Evropi zaradi migracije prebivalstva, tj. Vzrok za visoko frekvenco te mutacije je učinek ustanovitelja.

Obstajajo tudi druge bolezni s klinično sliko, ki spominja na klasično družinsko GC (tudi klasificirano kot tip 1 GC), vendar z drugačnim poreklom. Juvenilni GC (tip 2), pa tudi GC tipa 1, se deduje avtosomno recesivno in ga povzročajo mutacije v neznanem genu. GC tipa 3 je tudi recesivna bolezen in je povezana z mutacijo receptorja transferina. GC 4. in 5. vrste sta pretežno podedovana in sta posledica mutacij v genih ferroportina, ki prenašajo železo v črevesju, in feritin. Vse te oblike so zelo redke in danes njihova opredelitev nima praktične vloge.

Za pnevmatiko v genu HFE je značilna visoka penetracija glede na vmesni fenotip, to je biokemični znak presežka železa v telesu. 95% moških, starejših od 40 let, ki so homozigotni za to mutacijo, imajo presežek železa in obstajajo klinični znaki in simptomi. Pri ženskah v premenopavzi je tveganje zaradi izgube krvi med zdravljenjem manjše

menstruacijo. Fenotipski učinek mutacije GiS_bz-Asp je manj izrazit. Fibroza ali ciroza jeter se ugotovi z analizo biopsije pri 4-25% homozigotnih nosilcev alela Cis.₂₈₂

Strelišče Poleg tega je alel Cis₂₈₂-Tir predisponira razvoj hepatocelularnega karcinoma. Pri moških z GC in cirozo je relativno tveganje za razvoj hepatocelularnega karcinoma 200-krat večje.

PRESKUŠANJE MEDIJOV

Prisotnost zgoraj navedenih simptomov je indikacija za genetsko testiranje na GC. Vendar pa je diagnoza postavljena med razširjeno klinično sliko, ko je prepozno za preprečevanje primarne okvare. V zvezi s tem mnogi raziskovalci zagovarjajo potrebo po pregledu populacije za prisotnost GC. Ta bolezen izpolnjuje številne zahteve za bolezni, ki so podvržene presejanju, tj. pojavlja precej pogosto, ima latentno fazo pred kliničnimi manifestacijami, se zlahka diagnosticira z biokemičnimi in genetskimi metodami in se lahko prepreči s pomočjo učinkovitega in poceni zdravljenja.

Vendar se za zdaj množični pregledi štejejo za prezgodnje zaradi dvoumnosti, ki so večinoma povezane s penetracijo GC. Vsekakor je priporočljivo testirati sorodnike bolnikov z GC, ki morajo meriti stopnjo saturacije transferina z železom, vsebnost feritina in biokemičnih markerjev disfunkcije jeter, ter določiti prisotnost mutacij v genu HFE s položajem 282 in 63.

S tehničnega vidika odkrivanje teh mutacij ni težko. Pogosto se uporabljajo restrikcijske analize ali različne oblike alele-specifičnega pomnoževanja ali hibridizacije.

4.5.3.2. Dedna trombofilija

Trombofilija - nagnjenost k razvoju tromboze, povezane s prirojenimi in pridobljenimi motnjami strjevanja krvi in fibrinolizo. Trombofilija se najpogosteje pojavlja kot venska tromboza in trombembolija, ki se pojavljata s pogostnostjo približno 1 na 1000 prebivalcev na leto.

Obstajajo družinske oblike trombofilije, opisane že v petdesetih letih prejšnjega stoletja. Prvi odkriti vzroki dedne trombofilije (NTF) so bili pomanjkanje antitrombina III, t

proteina C in njegovega proteinskega kofaktorja S. Kasneje sta bili ugotovljeni še dve obliki NTF - mutacija koagulacije faktorja V, ki povzroča odpornost faktorja V na aktivirani protein C in mutacijo v protrombinskem genu G20210A, ki poveča raven protrombina v plazmi. Poleg tega je zmerna hiperhomocisteinemija, pogosto povezana z razširjenim polimorfizmom v genu MTHFR, tudi dejavnik tveganja za vensko trombozo.

TROMBOEMBOLSKA KOMPLIKACIJA Resnost kliničnih manifestacij NTF je zelo različna. Pogosto se pojavljajo v zelo blagi obliki in njihovo prisotnost lahko določimo le z laboratorijskimi metodami. Vendar pa v številnih primerih nosilci mutacij razvijejo globoko vensko trombozo spodnjih okončin, pljučno tromboembolijo, površinski tromboflebitis in venske tromboze druge lokalizacije. Te dedne okvare običajno niso povezane s tveganjem zaprtosti arterij. NTFs predispozicijo za razvoj tromboze v mladosti: do 40% bolnikov, mlajših od 45 let, z neizzvano globoko vensko trombozo ima eno od oblik NTF. Pri starejših bolnikih ali v prisotnosti povzročiteljev NTF opazili v 30% primerov tromboze. Pri bolnikih s kombinacijo dednih okvar se dodatno poveča tveganje za trombembolične zaplete.

Dedna pomanjkljivost antitrombina III in beljakovin C in S je skupaj manj kot 1% populacije, vendar je pri bolnikih z vensko tromboembolijo (VTE) ugotovljena v skoraj 10% primerov. Tveganje za VTE pri teh bolnikih je 5-8-krat večje kot pri splošni populaciji. Razlogi za pomanjkanje teh naravnih antikoagulantov so lahko zmanjšanje njihove sinteze ali (pogosteje) zmanjšanje funkcionalne aktivnosti proteina ob ohranjanju normalne ravni. Napake sinteze ali delovanja beljakovin povzročajo na stotine različnih mutacij v teh genih.

Dedna odpornost na aktivni protein C je najpogostejši vzrok NTF. V več kot 95% primerov je odpornost povzročena z missense mutacijo v genu faktorja V, ki se imenuje Leydenova, v kateri je na položaju 506 arginin nadomeščen z glutaminom. Ta aminokislinski ostanek običajno povzroči proteolitično cepitev faktorja V z aktivirano beljakovino C. Protein C je naravni antikoagulant, ki se aktivira s trombin-trombomodulinom.

kompleks na endotelijskih celicah in uničuje faktorje V_a in viii_a, povzroči ustavitev tvorbe tromba. Ta proces se znatno pospeši v prisotnosti proteina S, ki deluje kot proteinski kofaktor C. Če je v faktorju Va Arg substitucija aminokislin₅₀₆-Gln aktivirani protein C ga ne more razgraditi, kar vodi v ohranitev aktivnosti faktorja Va in povečano tvorbo tromba (sl. 4.17).

Leidenova mutacija se pojavlja skoraj izključno med belci, v katerih je približno 5% prebivalcev nosilcev. Zaradi visoke frekvence te genetske oblike v splošni populaciji pa se je treba sklicevati na polimorfizem

Sl. 4.17. Odpornost na aktivirani protein C, ki ga povzroči Leidenova mutacija.

v literaturi je bilo ime mutacije pritrjeno nanj. Med bolniki z VTE je pogostnost te mutacije večja in je približno 20%. Tveganje za VTE pri nosilcih Leidenove mutacije je odvisno od odmerka gena: v heterozigotih se poveča 2-7-krat, v homozigotih - 40–80-krat. Skupna verjetnost za nastanek tromboembolije med življenjem nosilcev te mutacije je 30%.

Polimorfni alel G20210A v 3'-neprevedenem območju protrombinskega gena v splošni populaciji se pojavlja s frekvenco 2%, pri bolnikih z VTE pa se delež nosilcev polimorfizma poveča na 7%. Tako prisotnost polimorfizma G20210A v protrombinskem genu poveča tveganje za VTE za približno 3-krat. Patološki učinek tega polimorfizma je povečanje aktivnosti protrombina v plazmi. Raven protrombina v homozigotih AA je 1,5-krat večja kot pri homozigotih v normalnem alelu GG, kar prispeva k trombozi. Očitno se mutacija G → A nanaša na tip mutacij s pridobitvijo funkcije, ker poveča učinkovitost obdelave 3'-konca mRNA, kar vodi do kopičenja mRNA in povečanja sinteze protrombinskega proteina.

Še en predispozicijski faktor za trombozo je povečana raven homocisteina, aminokisline, ki nastane med presnovo metionina. Zmerno zvišanje homocisteina poveča tveganje za arterijsko in vensko trombozo. Razlog za povečanje je lahko nenormalna prehrana (pomanjkanje piridoksina, kobalamina, folata) ali genetski dejavniki, kot je polimorfizem Al.₆₇₇

Gred v genu metilenetetrahidrofolat reduktaze - encim, ki igra pomembno vlogo pri določanju ravni homocisteina v plazmi. Aktivnost te variante encima je le približno 1/3 normale. Približno 10% belcev je heterozigotnih nosilcev tega polimorfizma. Pogostnost VTE pri izoliranih nosilcih tega polimorfizma se ne razlikuje od normalne, vendar številni podatki kažejo, da polimorfizem C677T prispeva k manifestaciji drugih NTF.

BEREMENALNOST IN OBSTETARNA PATOLOGIJA Med nosečnostjo se raven koagulacijskih faktorjev, odvisnih od vitamina K, poveča, vsebnost beljakovin S se zmanjša, fibrinoliza pa se zavira. Te spremembe so fiziološko izvedljive, saj so namenjene zmanjševanju izgube krvi med porodom, povečujejo pa tudi verjetnost VTE med nosečnostjo (2,5-krat) in zlasti v porojenem obdobju (20-krat).

V prisotnosti NTF je ta verjetnost še višja in lahko doseže 100-kratno homozigot za Leidenovo mutacijo faktorja V. Večina (do 60%) žensk z VTE, ki so se razvile med nosečnostjo, ima Leidenovo mutacijo.

Poleg venske trombembolije NTFs prispevajo k razvoju porodnične patologije. Kršitev popolne cirkulacije posteljice maternice zaradi tromboze lahko privede do različnih zapletov nosečnosti, kot so spontani splav, mrtvorojeni, ablacija placente, preeklampsija in intrauterina zaostanek rasti. Številne študije so pokazale povečano pojavnost NTF pri bolnikih s temi zapleti. Obstajajo tudi dokazi, da lahko prisotnost mutacije ne samo pri materi, ampak tudi v plodu, še dodatno poveča tveganje za trombozo in infarkt placente, kar vodi do izgube ploda. Relativno tveganje zapletov nosečnosti pri heterozigotnih nosilcih Leidenove mutacije ali polimorfizma protrombinskega gena G20210A po različnih študijah se je v povprečju povečalo za 2-3 krat.

Sprejemanje peroralnih kontraceptivov prispeva tudi k razvoju VTE. Ta učinek se poveča pri ženskah z NTF. Tveganje za razvoj VTE pri nosilcih Leidenove mutacije, ki jemljejo peroralne kontraceptive, se po različnih ocenah poveča za 20-65 krat. V prisotnosti protrombina G20210A je tveganje za VTE nekoliko nižje, vendar tudi znatno presega normalno vrednost. Na podlagi teh opažanj je priporočljivo, da ne uporabljate peroralnih kontraceptivov za ženske s pomanjkanjem naravnih antikoagulantov, homozigotov za Leydenovo mutacijo in v prisotnosti kombiniranih okvar.

Nadomestno hormonsko zdravljenje po menopavzi je drugo jatrogeno stanje s 2-4-kratnim povečanjem tveganja za VTE. V prisotnosti Leidenove mutacije se lahko relativno tveganje poveča za 15-krat in poveča tudi pogostost ponavljajoče se tromboze. V zvezi s tem nosilci NTF, ki so imeli epizode VTE, ni priporočljivo uporabljati hormonskega nadomestnega zdravljenja.

INDIKACIJE ZA GENETIČNO ANALIZO Analiza Leidenove mutacije in protrombinskega polimorfizma G20210A ter določanje pomanjkanja antitrombina in proteinov C in S je učinkovita metoda za identifikacijo posameznikov s povečanim tveganjem za trombotične bolezni. Z odkrivanjem teh mutacij lahko nosilci izvajajo profilaktično antikoagulantno terapijo.

Zaradi nizke absolutne frekvence VTE množični pregled populacije za prisotnost NTF ni upravičen. Bolj primerno je preučiti naslednje skupine bolnikov za prisotnost NTF: t

• osebe z VTE, ne glede na starost in resnost manifestacij;

• ženske z enim ali več spontanimi splavi v pozni fazi ali z dvema ali več spontanimi splavi;

• nosečnice z intrauterino zaostalostjo v rasti ali abrupijo posteljice;

• sorodniki prve stopnje sorodnosti bolnika z NTF v zgodovini;

• ženske z družinsko anamnezo NTF pred uporabo peroralnih kontraceptivov, hormonskega nadomestnega zdravljenja ali nosečnosti.

DIAGNOSTIČNI PRESKUSI Preskusi z visoko prioriteto za prisotnost NTF vključujejo naslednje:

• določanje aktivnosti antitrombina (amidolitična metoda);

• določanje aktivnosti proteina C (koagulometrična ali amidolitična metoda);

• določanje koncentracije proteina S (frakcije celotnega in prostega antigena);

• koagulometrično določanje odpornosti na aktivirano beljakovino C;

• določitev Leidenove mutacije faktorja V;

• določanje protrombinskega polimorfizma G20210A;

• določanje ravni homocisteina v plazmi.

Kot je razvidno iz zgornjega seznama, se pomanjkanje antitrombina in proteinov C in S določi s funkcionalnimi metodami. To je posledica dejstva, da so te napake posledica velikega števila mutacij in da jih je treba poiskati z veliko truda in stroškov, funkcionalne analize pa so preproste in zanesljive.

Analiza Leidenove mutacije in protrombinskega polimorfizma je enostavna in dobro dopolnjuje funkcionalne teste. Očitno analiza polimorfizma C677T v genu metilen tetragid rofolatreduktaze nima ločene diagnostične vrednosti in ga je treba uporabiti v kombinaciji z biokemično določitvijo koncentracije homocisteina v plazmi. Uporaba tega sklopa testov omogoča odkrivanje dedne okvare koagulacijskih faktorjev ali povečanje homocisteina pri približno 40% bolnikov z VTE.

Najbolj zanesljiva metoda za identifikacijo Leidenove mutacije in protrombina G20210A je restrikcijska analiza, vendar pa se široko uporabljajo tudi alelno specifični PCR in hibridizacija.

4.5.3.3. Družinska hiperholesterolemija

Domača hiperholesterolemija (FHC) je očitno najpogostejša avtosomno dominantna bolezen človeka. Frekvenca FHD v večini populacij je 1 na 500. V populacijah z učinkom ustanovitelja so heterozigotne oblike veliko pogostejše: 1 od 70 v afrikanerjih v Južni Afriki in 1 od 200 v kanadčkih francoskega izvora. Iz istega razloga se poveča pogostost FHD v Fincih, Druzah in Libanoncih.

Klinično ne diagnosticiramo vseh primerov FHC. V Rusiji je na primer manj kot 1% bolnikov s FHCS postavilo klinično diagnozo, najbolj učinkovita diagnoza (več kot 40% identificiranih nosilcev) pa je bila izvedena na Islandiji zaradi majhne velikosti populacije z izrazitim učinkom ustanovitelja in majhno spremenljivostjo mutabilnosti.

Glavne diagnostične značilnosti SGHS so povišan holesterol v krvi, prisotnost ksantomov tetive pri bolniku ali sorodniki prve stopnje in prevladujoči vzorec dedovanja zvišanega holesterola ali ishemične bolezni srca.

Klinično se SGHS manifestira s povečanim tveganjem za aterosklerozo in njene zaplete. Mehanizmi, ki povezujejo povečanje holesterola z razvojem bolezni koronarnih arterij, niso popolnoma razumljivi. Predvideva se, da visoka raven LDL, ki je bogata s holesterolom, prispeva k njihovemu prodiranju v steno posode, kjer oksidirajo in sprožijo verigo celičnih reakcij, ki vodijo v kopičenje lipidov in lokalno reorganizacijo stene žile, kar povzroči aterosklerotični plak. V primeru FHC se tveganje smrti zaradi miokardnega infarkta v mladosti - do 40 let - poveča 100-krat. Pri nezdravljenih moških s FHD do starosti 60 let je verjetnost CHD približno 75%. Po nekaterih ocenah je samo polovica moških, ki imajo SGHS, stara 60 let. Povprečna starost začetka implantacije je 40 do 45 let za moške, za ženske pa 10 let. Tako se bolezen koronarnih arterij pri bolnikih s FHD razvije 10–20 let prej kot populacijsko povprečje.

Statini in druga zdravila za zniževanje lipidov se učinkovito uporabljajo za zmanjšanje ravni lipoproteinov v plazmi v SHHS.

Najresnejše bolnike (praviloma so homozigotni primeri) zdravimo z odstranitvijo presežnega LDL z izmenjavo plazme. Včasih se uporabi presaditev jeter.

BIOKEMIJSKI IN GENETSKI MEHANIZMI

Ko se holesterol SGHS poveča zaradi povečanja LDL v plazmi. Ta presnovna motnja je povezana z zmanjšanjem očistka LDL v jetrih, kar je posledica zmanjšanja izražanja ali aktivnosti celičnih receptorjev, ki posredujejo vnos LDL-delcev (receptorjev LDL). Aktivnost LDL receptorja v FHCS se zmanjšuje na vseh celicah, ki izražajo ta receptor, vendar so funkcionalne posledice povezane predvsem z okvaro receptorja v jetrih, ker kršitev pretvorbe holesterola v žolčne kisline vodi do zmanjšanja njegovega izločanja skozi črevesje. Podobne biokemične anomalije so opažene z mutacijsko spremembo v proteinu apoB-100, ki je ligand za LDL receptor. Zaradi te mutacije LDL receptorji ne prepoznajo več delcev LDL in se kopičijo v plazmi.

Gen receptorja LDL vsebuje 18 eksonov, ki kodirajo šest funkcionalnih domen tega proteina: signalni peptid, domeno za vezavo liganda, domeno, homologno predhodniku epidermalnega rastnega faktorja, mesto O-glikozilacije, transmembransko in citoplazmatsko domeno. Vse znane mutacije v genu LDLR so zbrane v podatkovni bazi UMD-LDLR, ki je dostopna prek interneta. Število vpisov je preseglo 800 in se še naprej povečuje. V skladu z bazo podatkov UMD-LDLR predstavljajo zamenjave posameznih nukleotidov 90% vseh mutacij v genu LDLR, večinoma so to misensne in nesmiselne mutacije. Preostalih 10% so predvsem makrotransformacije, ki so posledica neenake rekombinacije z več kot 30 kopijami sekvenc Alu, prisotnih v tem genu. V promotorju so našli manj kot 10 mutacij.

Čeprav je SGHS monogenska bolezen, se fenotipska ekspresija, to je resnost IHD, zelo razlikuje tudi med bolniki, ki imajo iste mutacije. Nekateri bolniki živijo 80 let ali več, drugi pa 20 let zaradi srčnega napada. Dejavniki, ki vplivajo na klinične manifestacije, so lahko zunanji, presnovni in genetski.

Od okoljskih dejavnikov imajo kajenje in prehranjevalne navade posebno vlogo. Kajenje je eden od najmočnejših napovedi umrljivosti zaradi koronarne bolezni srca pri bolnikih s FHD. Vloga prehrane v razvoju

FHCS so dokazali s primerjavo bolnikov s kitajskim poreklom, ki živijo v Kanadi, s nosilci istih mutacij, vendar živijo na Kitajskem.

Kanadski Kitajci imajo LDL holesterol za 70% višji kot na Kitajskem. Poleg tega je 6 od 16 heterozigotov, ki so živeli v Kanadi, imelo ksantome, 4 pa so imeli CHD. Nobeden od 18 anketiranih, ki so živeli na Kitajskem, ni imel ksantoma ali ishemične bolezni srca. Očitno so takšne razlike v kliničnih manifestacijah povezane z različno porabo nenasičenih maščob. Ta primer živo ponazarja spreminjajoče se učinke zunanjih dejavnikov, kot je prehrana, na fenotip heterozigotne SHKS.

Potek bolezni je močno odvisen od vrste mutacije, ki povzroča hiperlipidemijo. Najhujša hiperholesterolemija se razvije v prisotnosti ničelnih mutacij, kar povzroči popolno odsotnost aktivnega receptorja, medtem ko mutacije z ohranjanjem delne sinteze ali aktivnostjo LDL receptorjev običajno povzročijo blažjo bolezen.

Obstajajo številni biokemični parametri, ki spreminjajo razvoj bolezni koronarnih arterij pri bolnikih s SHHS. Ti presnovni dejavniki so: HDL holesterol, C-reaktivni protein in fibrinogen. Nekateri od teh dejavnikov, kot so HDL-holesterol in lipoprotein Lp (a), imajo izrazito genetsko osnovo. Drugi dokazani ali domnevni genetski dejavniki vključujejo mutacije v lipoproteinski lipazni geni - apolipoprotein E izooblike, variante beljakovin holesterolnih estrov, polimorfizem paraoksonaze (polimorfizem lipidnega peroksida), poseben genotip metilen tetrahidrofolat reduktaze (povezan s povečano ravnijo homocisteina). kot tudi mikrosomski protein za prenos trigliceridov, ki vpliva na izločanje VLDL.

Tako so genetsko mutacije receptorja LDL glavni dejavnik, ki določa razvoj FHC. Prispevek drugih genov je neizpodbiten, vendar je zaradi relativno majhnega števila bolnikov z identificiranimi mutacijami receptorja LDL potrebna nadaljnja študija modifikacijskih genov. V idealnem primeru bo določitev pacientovega genotipa s temi dodatnimi geni omogočila določitev stopnje tveganja za koronarno arterijsko bolezen in drugih zapletov pri nosilcih določene mutacije v LDL receptorju ali apoB-100 genu.

Individualna raven holesterola je podvržena naravnim spremembam, zato ni mogoče sklepati na podlagi ene meritve holesterola

o razpoložljivosti SGHS. Poleg tega je raven holesterola odvisna od starosti, spola in se spreminja v različnih populacijah. Raven holesterola v FHCS pogosto presega povprečno raven v splošni populaciji, zato je nemogoče diagnosticirati na podlagi rezultatov merjenja holesterola v nekaterih primerih.

Trenutno je odkrivanje mutacij v LDL receptorju ali apoB-100 genu pogost kriterij pri diagnozi FHC. Mutacija na 3500 nukleotidu v genu apoB-100 (družinska okvara apoB) je najpogostejši vzrok za FHC v večini populacij. V Evropi in državah, kjer živijo ljudje iz Evrope (Avstralija, ZDA, Kanada in Nova Zelandija), je ta mutacija povzročena pri 3-5% bolnikov s FHCS. V državah s kompleksno genetsko strukturo bolezni lahko mutacije najdemo v 30-50% bolnikov s klinično diagnozo SGHS. To je posledica neustrezne občutljivosti presejalnih metod in napačne diagnoze, ugotovljene na podlagi ravni holesterola in kliničnih manifestacij. Obstaja tudi možnost obstoja dodatnih genov, poleg LDLR in APOB, mutacije, pri katerih spremlja podobna klinična slika.

V številnih populacijah je DNK diagnostika SGHS bistveno poenostavljena zaradi prisotnosti omejenega števila mutantnih alelov.

Vendar pa v večini gensko odprtih populacij, kamor sodi Rusija, nobena posamezna mutacija v genu za receptorje LDL ni pogostejša kot pri 1% bolnikov s FHC in običajno veliko manj pogosto. V zvezi s tem imajo pri analizi DNK FHCS pomembno vlogo presejalne metode za iskanje mutacij, kot je določanje polimorfizma konformacije enojne verige DNA, ki mu sledi potrditev s sekvenciranjem.

4.5.3.4. Cistična fibroza

Cistična fibroza (CF) je ena najpogostejših in hkrati hudih avtosomno recesivnih bolezni pri ljudeh. Med Evropejci je nosilna frekvenca približno

1 do 50, in klinične oblike se pojavijo glede na regijo s pogostnostjo od 1 do 2-3 tisoč ljudi.

CF je dobil ime po naravi mikroskopskih sprememb, ki so jih pri teh bolnikih opazili v trebušni slinavki. Bolezen prizadene tudi pljuča, jetra, tanko črevo in moški reproduktivni sistem. Ključno vlogo pri patogenezi ima prekomerno izločanje sluzi z epitelijem teh organov, kar vodi v obstrukcijo bronhijev ali izločajočih se kanalov jeter in trebušne slinavke. Kljub znatnemu izboljšanju simptomatskega zdravljenja bolniki s CF običajno ne živijo dlje kot 20-30 let. Glavni vzrok smrti je poškodba pljuč, ki jo povzroči blokada bronhijev, kar ustvarja ugodno okolje za sekundarne okužbe. Kronične okužbe in vnetna reakcija vodijo do fibroze pljučnega tkiva, ki lahko skupaj z obstrukcijo dihal povzroči respiratorno odpoved. Pri 65% bolnikov zamašitev kanalov trebušne slinavke preprečuje izločanje prebavnih encimov v črevesje, kar vodi v prebavne motnje. Podobno je kršitev izločanja žolča v jetrih, opaženo pri 5% bolnikov. Poleg teh pojavov se pri 10% novorojenčkov razvije obstrukcija črevesja, ki zahteva kirurški poseg. Poleg tega je 95% moških s CF imelo neplodnost. Značilna značilnost CF, ki se pogosto uporablja za diagnozo, je povečana slanost znoja, povezana z oslabljeno reabsorpcijo C1.

epitelij, ki obdaja kanale znojnih žlez.

KF povzročajo mutacije v proteinu, ki ga kodira gen CFTR (transmembranski regulator prevodnosti cistične fibroze). Ta gen je sestavljen iz 27 eksonov in kodira protein z molekulsko maso 168 kDa, ki vsebuje dve transmembranski domeni, dve intracelularni domeni za vezavo nukleotidov in regulatorno področje. Ta beljakovina je kanal za C1 - ione. Ta kanal aktivira cAMP-odvisna proteinska kinaza, ki fosforilira regulatorno področje. Izhod C1 - iz celice se začne veriga reakcij, ki vodijo do zaprtja kanalov Na + in povečajo nastajanje sluznice.

Najpogostejši vzrok za CF je izbris treh nukleotidov v 508. kodonu, kar vodi do izgube fenilalanina. Pogostnost te mutacije se pri bolnikih s CF razlikuje od 50% v srednji Evropi do skoraj 90% v severni Evropi. Zaradi te mutacije se normalna obdelava proteina prekine in po sintezi se ne prenese v plazemsko membrano, ampak se zadrži v endoplazmatskem retikulumu in razgradi. Vendar pa obstaja veliko število

druge mutacije, ki poškodujejo ta protein; Te bolj redke mutacije imajo lahko drugačen učinek na kloridni kanal, na primer delno ali v celoti zmanjšajo sintezo beljakovin, motijo njen znotrajcelični transport ali zmanjšajo funkcionalno aktivnost kanala. Nekatere od teh mutacij povzročijo le delno zmanjšanje sinteze ali aktivnosti kanala, kar lahko privede do različnih funkcionalnih pojavov. V primerih, ko se ohrani manj kot 3% aktivnosti, se razvije huda CF, ki jo spremlja poškodba trebušne slinavke. Če prihranite 3-8% dejavnosti vpliva na pljuča, in trebušna slinavka je normalno. Če je aktivnost kanala C1 8–12%, se pri moških opazijo blage oblike, kot je azoospermija. Vendar pa tako preprosto razmerje ni vedno upoštevano. Predvidite potek bolezni je mogoče le, če obstaja homozigotnost za delecijo fenilalanina-508 ali sočasna prisotnost te delecije in mutacije G551D. Ob prisotnosti teh mutacij bolezen poteka v klasični hudi obliki z lezijo trebušne slinavke. V večini drugih primerov je težko napovedati razmerje med vrsto mutacije in manifestacijo bolezni. Vse več je dokazov, da je CF oligogena bolezen in da njene fenotipske manifestacije niso odvisne le od narave mutacije, ampak tudi od vrste modificiranih genov, ki so prisotni v pacientu.

CF se lahko skoraj vedno diagnosticira v prenatalni fazi z analizo DNK iz horionskih resic, bodisi z neposredno dolocitvijo mutacij bodisi z uporabo analize povezav z uporabo polimorfnih intragenih markerjev v primerih, ko mutacije pri bolnem otroku niso znane. Trenutno se preučuje vprašanje pregledovanja populacije za prisotnost CF. Zbrane informacije o genetski strukturi CF so nam omogočile, da smo izbrali 30 mutacij iz skoraj 1000 znanih, kar pa pojasnjuje 90% primerov CF v različnih regijah Evrope in ZDA. Tehnično je DNK diagnostika CF-jev precej dobro razvita, za njeno izvedbo pa so izdelana številna komercialna kompleta.

4.5.3.5. Hipertrofična kardiomiopatija

Hipertrofična kardiomiopatija (HCM) je ena najpogostejših človeških bolezni z izrazito genetsko nagnjenostjo. Pojavi se s frekvenco 1 na 500, kar je bistveno višje od pogostnosti druge družinske oblike kardiomiopatije - razširjene (1 na 2500). HCM je podedovan

na avtosomno prevladujočem tipu in je značilna za penetracijo do 75%. Klinično se bolezen manifestira v obliki leve in / ali desne ventrikularne hipertrofije in povečanja atrijske velikosti. Hipertrofija je običajno asimetrična in vpliva na interventrikularni septum. Histološko opazimo hipertrofijo in nepravilno razporeditev kardiomiocitov ter intersticijsko fibrozo v srčni mišici. Bolezen vodi do aritmij in nenadne smrti, pa tudi do srčnega popuščanja.

Vzrok bolezni na molekularni ravni je disfunkcija beljakovin, ki sestavljajo sarcomere, zato se hcmp včasih imenuje sarcomerejeva bolezen. Hipertrofija je kompenzacijski miokardni odziv na zmanjšanje kontraktilnosti. Trenutno je identificiranih 11 genov, pri katerih mutacije vodijo v hcmp (tabela 4.11).

Mutacije sarkomernih proteinov imajo drugačen učinek na kontraktilno funkcijo kardiomiocitov. Posledica tega je, da misensne mutacije pogosto tvorijo stabilne, vendar neaktivne beljakovine, ki se vstavijo v sarkomer in motijo njegovo delovanje, tj. negativni učinek. Nasprotno, mutacije

Tabela 4.11. Mutacije, ki vodijo do hipertrofične kardiomiopatije

s premikom okvirja povzročijo nastanek neaktivnih skrajšanih proteinov, ki so podvrženi pospešeni razgradnji. V obeh primerih se zmanjša kontraktilna aktivnost in razvije se kompenzacijska hipertrofična reakcija.

Vrsta mutacije lahko vpliva na resnost bolezni. Na primer, visoko tveganje za nenadno srčno smrt je povezano z mutacijami v genu MYH7 Arg_4oz-Gln, Arg_45з-Cis in arg_72з-Gly Nasprotno, mutacija Gly_25b-Glu, Val₆₀₆-Met in Lei₉₀₈- Shaft ni povezan s povečanim tveganjem za aritmije. Mutacije v genu MYBPC3 so običajno povezane z blago hipertrofijo pri mladih bolnikih, poznem nastopu bolezni in relativno ugodni prognozi. Tako poznavanje vrste mutacije ne potrjuje le diagnoze hcmp, ampak v nekaterih primerih pomaga pri določanju prognoze.

Zaradi velike genetske heterogenosti je molekularna diagnoza hcmp določena kompleksnost. Zaradi raznolikosti mutacij se za iskanje te bolezni uporabljajo predvsem presejalne metode, kot je analiza polimorfizma konformacije enoverižne DNA, elektroforeza v denaturantnem gradientu in tudi denaturna HPLC. Iskanje mutacij se izvaja predvsem v genu težke verige β-miozina, kot tudi v genih srčnega troponina T in srčnega miozin-vezavnega proteina C.

Biokemijska diagnoza bolezni jeter. Kratke informacije o strukturi jeter.

Biokemijska diagnoza bolezni

Dekodiranje biokemične analize krvi

Kaj pokaže biokemični test krvi?

Kakšne so indikacije za biokemijsko analizo krvi?

Kako opraviti krvni test za biokemijo?

Norme biokemijske analize krvi (tabela)

Kako dešifrirati biokemijsko analizo?

Skupaj beljakovin

Bilirubin

Encimi

Sečna kislina

Koliko je biokemični test krvi?

Biokemija in patobiokemija jeter. Biokemijska diagnoza bolezni jeter

Biokemijska diagnoza bolezni

POGLAVJE 4 BIOKEMIJSKA DIAGNOSTIKA PATOLOŠKIH PROCESOV IN ZDRAVSTVENIH BOLEZNI

Preberite Več O Čiščenje Jeter

Priljubljene Kategorije

Cista Jeter

Rak Jeter