Načelo Štetje levkocitov med mikroskopijo na določenem številu kvadratov komore za štetje in izračun njihovega števila v 1 litru krvi ob upoštevanju razredčitve krvi in prostornine števne komore.
Reagent: 3-5% raztopina ocetne kisline, obarvana za obarvanje jeder levkocitov z nekaj kapljicami raztopine metilen modrega. Raztopina ima modro barvo, jo lahko shranjujete dolgo časa.
Potek odločnosti. V suho epruveto vlijemo 0,4 ml raztopine ocetne kisline. S prstom se zbere 0,02 ml krvi (lahko uporabite vensko kri, stabilizirano s antikoagulanti). Obrišite konico pipete, nato pustite kri iz nje na dno epruvete, premešajte, ponovno pokličite in pustite mešanico krvi in reagenta (pipetiranje). Označite epruveto in jo pustite do štetja. Shranjevanje mešanice krvi z raztopino ocetne kisline se priporoča ne več kot 2-4 ure.
Kri, razredčena v epruveti z ocetno kislino, dobro premešamo in napolnimo s štetno komoro. Napolnjena komora se pusti v vodoravnem položaju 1 min, da se usede bele krvne celice. Brez spreminjanja vodoravnega položaja fotoaparata ga postavijo na mizo mikroskopa in pri nizki povečavi (okular 10 ×, leča 8 ×) preštejejo bele krvne celice v 100 velikih kvadratih, kar ustreza 1600 majhnim.
Za večjo natančnost se levkociti preštejejo po mreži na velikih kvadratih, ki niso razdeljeni na majhne kvadrate in proge, začenši od zgornjega levega vogala mreže. Za boljši kontrast potemnite vidno polje, spustite kondenzator in zaprete zaslonko. Celice, ki se nahajajo znotraj kvadrata in ležijo na dveh linijah, se štejejo, da ne bi dvakrat šteli iste celice.
Izračun števila levkocitov se izvede po formuli:
kjer je X število levkocitov v 1 μl krvi; in - število levkocitov v 100 velikih kvadratih; 20 - redčenje krvi; 100 je število velikih kvadratov; 250 je pretvorbeni faktor na 1 μl, ker je prostornina enega velikega kvadrata 1/250 μl (stran kvadrata je 1/5 mm, višina je 1/10 mm).
V praksi je za izračun števila levkocitov v 1 μl krvi njihovo število v 100 velikih kvadratih pomnoženo s 50 in v 1 litru - dobljena vrednost se pomnoži s 106.
Opomba Pri štetju levkocitov je napaka neizogibna v 6–8% primerov.
- Z velikim številom normocitov v periferni krvi se štejejo v število levkocitov (obe levkociti in normociti - celice z jedrom). Za pravilno določitev števila levkocitov je treba od skupnega števila nukleiranih krvnih celic odšteti število normocitov.
- Preostale napake so podobne tistim, ki se pojavijo pri izračunu števila rdečih krvnih celic v komori za štetje.
Število levkocitov
Za zbiranje krvi v mešalniku levkocitov do oznake 0,5. Takoj v kri dodamo raztopino za redčenje 3% ocetne kisline, da označimo 11. Vsebino kapilare temeljito premešamo in z njo ponovno napolnimo komoro Goryaev. Štetje se izvaja na vsaj 100 velikih kvadratih. To so velike neoznačene črte, ki so razvrščene v štiri v mrežo Goryavove kamere. Izračunajte število levkocitov v 1 l krvi po formuli:
L = N x 4000 x 20 x 10 6
kjer je: N število levkocitov v sto velikih kvadratih; 4000 je množitelj, ki zmanjša volumen majhnega kvadrata na volumen 1 μl krvi; 20 - popravek za stopnjo krvne raztopine; 1600 - število levkocitov v majhnih kvadratih; 10 6 - število mikrolitov v 1 l.
Priporočila za registracijo
V zaključku primerjajte rezultate, dobljene z normalnimi vrednostmi.
Lab № 7.3
Določanje količine hemoglobina v krvi
194.48.155.245 © studopedia.ru ni avtor objavljenih gradiv. Vendar pa ponuja možnost brezplačne uporabe. Ali obstaja kršitev avtorskih pravic? Pišite nam Povratne informacije.
Onemogoči adBlock!
in osvežite stran (F5)
zelo potrebno
Štetje števila belih krvnih celic
Levkocitoza je lahko absolutna (resnična) in relativna (redistributivna).
Absolutno levkocitozo opazimo pri akutnih vnetnih procesih, nekrozah tkiv, akutnih bakterijskih okužbah (z izjemo tifusne vročine, bruceloze, tularemije itd.), Alergijskih stanj, malignih tumorjev (z uničenjem tkiva), zaprtih poškodb glave in krvavitev v možganih, sladkorne bolezni. uremična koma, šok, akutna izguba krvi, kot primarna reakcija - z radiacijsko boleznijo. Pri levkemiji pride do znatnega povečanja števila levkocitov.
Relativna (redistributivna) je posledica prejema levkocitov v pretoku krvi iz organov, ki služijo njenemu skladišču. Pojavi se po jedi (levkocitoza hrane), vročih in hladnih kopelih, močnih čustvih (vegetovaskularna levkocitoza), intenzivnem mišičnem delu (miogena levkocitoza) itd.
Leukopenija Leukopenija velja za indikator inhibicije funkcionalne sposobnosti kostnega mozga zaradi izpostavljenosti strupenim snovem (arzen, benzen itd.), Nekatera zdravila (sulfanilamidi, kloramfenikol, butadion, imuno, ciklofosfamid itd.), Virusi (gripa, virusni hepatitis)., ošpice itd.), mikrobi (tifus, bruceloza itd.), ionizirajoče sevanje, rentgenski žarki in hipersplenizem (povečana funkcija vranice).
Za levkocitozo in levkopenijo je značilno, da je sorazmerno povečanje (zmanjšanje) skupnega števila vseh vrst levkocitov (npr. Levkocitoza z zgoščevanjem krvi); v večini primerov se poveča (zmanjša) število kateregakoli tipa celic, zato se uporabljajo izrazi "nevtrofilija", "nevtropenija", "limfocitoza", "limfopenija", "eozinofilija", "eozinopenija", "monocitoza", "monocitopenija"., "Bazofilija."
Pri klinični oceni sprememb števila levkocitov je velik pomen pripisan odstotnemu razmerju posameznih oblik levkocitov, to je levkocitne formule.
Levkocitna krvna slika zdrave osebe:
Relativni znesek Absolutni znesek
Bazofili ……………………….0-1% 0-0.0650 x 10 9 / l
Eozinofili …………………….0.5-5% 0.02-0.30 x 10 9 / l
Neutrofili: - mielociti............ 0% odsotni
- zabodel... 1-6% 0,040-0,300 x 10 9 / l
- segmentirano….47-72% 2,0-5,5 x 10 9 / l
Limfociti …………………………….19-37% 1,2-3,0 x 10 9 / L
Monociti ………………………….3-11% 0,09-0,6 x 10 9 / L
Štetje levkocitov se izvaja pri obarvanih razmazih periferne krvi. Za pravilno interpretacijo rezultatov študije levkocitne formule je priporočljivo šteti v absolutnih količinah, ne pa v relativnih. Najpogostejše metode slikanja brisov Romanovskega-Giemsa, Pappenheim. Pri potopitvi se prešteje vsaj 200 celic in nato izračuna odstotno razmerje nekaterih vrst levkocitov. Analiza levkograma ob upoštevanju drugih krvnih parametrov in klinične slike je dragocena metoda pregleda, pomaga pri diagnozi in določanju prognoze bolezni.
Glavni vzroki nevtrofilije.
Akutne bakterijske okužbe - lokalizirane in generalizirane.
Vnetje ali nekroza tkiva.
Zdravilni učinki (kortikosteroidi).
Glavni vzroki nevtropenije.
Okužbe - bakterijske (tifus, bruceloza, tularemija, paratifus) in virusne (infekcijski hepatitis, ošpice, gripa, rdečke in drugi).
Mielotoksični učinki in supresija granulocitopoeze (ionizirajoče sevanje; kemična sredstva - benzen, anilin, DDT; zdravilni učinki - citostatiki in imunosupresanti; vitamin B12-anemija pomanjkanja folne kisline, akutna alevkemična levkemija, aplastična anemija).
Izpostavljenost protiteles (imunske oblike) - preobčutljivost na zdravila, avtoimunske bolezni (SLE, revmatoidni artritis, kronična limfna levkemija), izoimunske manifestacije (hemolitična bolezen novorojenčka).
Prerazporeditev in odlaganje v organih - šok, bolezni s splenomegalijo in hipersplenizem.
Dedne oblike (družinska benigna kronična nevtropenija).
Glavni vzroki eozinofilije.
Parazitske invazije (trihinoza).
Kronične kožne spremembe - luskavica, pemfigus, ekcem.
Tumorji (eozinofilne variante levkemije).
Druge bolezni - fibroplastični endokarditis Lefflera, škrlatinka.
V fazi okrevanja okužb in vnetnih bolezni (ugoden prognostični znak).
Vzroki eozinopenije (aneozinofilija).
Povečana aktivnost adrenokortikosteroidov v telesu.
Glavni vzroki za bazofilijo:
Kronična mieloidna levkemija in eritremija.
Glavni vzroki monocitoze.
Subakutne in kronične bakterijske okužbe.
Parazitske okužbe - leishmaniasis, malarija.
Hemoblastoza - monocitna levkemija, limfogranulomatoza, limfomi.
Druga stanja so SLE, sarkoidoza, revmatoidni artritis, infekcijska monocitoza; v obdobju okrevanja po okužbah, pri opustitvi agranulocitoze, po splenektomiji.
Zmanjšanje števila monocitov je pomembno predvsem pri ocenjevanju limfocitno-monocitnega razmerja pri pljučni tuberkulozi.
Glavni vzroki limfocitoze.
Okužbe - akutne virusne (infekcijska mononukleoza, ošpice, rdečke, piščanci), kronične bakterije (tuberkuloza, sifilis, bruceloza), protozojske (toksoplazmoza).
Hemoblastoza (limfocitna levkemija, limfom).
Druge bolezni - hipertiroidizem, Addisonova bolezen, vitamin B12-anemija zaradi pomanjkanja folij, hipo-in aplastična anemija.
Limfocitopenija je opažena pri SLE, Hodgkinovi bolezni, razširjeni tuberkulozi bezgavk, v terminalnem stadiju ledvične odpovedi, akutni radiacijski bolezni, stanju imunske pomanjkljivosti, jemanju glukokortikoidov.
Povečanje ali zmanjšanje števila nekaterih vrst levkocitov v krvi je lahko relativno ali absolutno. Če se pojavlja le odstotek določene vrste sprememb belih krvnih celic, potem pride do relativne nevtrofilije, relativne eozinopenije itd. Povečanje ali zmanjšanje absolutne vsebnosti vseh vrst levkocitov, to je število teh celic na enoto volumna krvi, se imenuje absolutna nevtrofilija, absolutna eozinopenija itd.
Premik formule na levo (povečanje števila mladih oblik nevtrofilcev) je znak vnetja ali nekrotičnega procesa v telesu.
Premik levkocitne formule v desno je značilen za radiacijsko bolezen in vitamin B12-anemija pomanjkanja folne kisline.
Odsotnost ali znatno zmanjšanje števila vseh vrst zrnatih levkocitov - granulocitov (nevtrofilcev, eozinofilcev, bazofilcev) označuje izraz agranulocitoza. Glede na mehanizem pojavljanja se razlikujejo mielotoksičnost (učinki ionizirajočega sevanja, citostatični vnos) in imunski (hapten in avtoimunska agranulocitoza).
Število levkocitov
Metoda štetja v fotoaparatu. Jemanje in redčenje krvi po metodi cevi. V cev vstavimo 0,4 ml tekočine za redčenje in 0,02 ml kapilarne krvi (po možnosti Vidalevskaya). Rezultat redčenja je praktično 1:20, običajno se kot razredčilo uporablja 3-5% raztopina ocetne kisline, obarvane z metilensko modro (lizi ocetne kisline, eritrociti, metilen modro barvo, jedra levkocitov). Pred polnjenjem komore Goryaeva cev z razredčeno kri se temeljito pretrese. Komora je napolnjena na enak način kot pri štetju rdečih krvničk.
Levkociti so veliko manjši od eritrocitov (1–2 na velik kvadrat), zato se za natančnost štejejo v 100 velikih kvadratih (nerazvrščenih). Izračun: 100 velikih kvadratov (1600 majhnih) se štejejo za levkocite.
Spomnimo se, da je volumen majhnega kvadrata 1/4000 mm3 in da je kri razredčena 20-krat, število levkocitov v 1 μl krvi je izračunano: 4000 20 in deljeno s 1600 = a x 1/2. Praktično, da bi dobili dejansko vsebnost levkocitov v 1 μl krvi, je dovolj, da delimo na polovico število, dobljeno v izračunu in dodamo 2 ničli. Povprečna napaka metode je ± 7%.
Natančnejša (2-3% napaka) in popolna je število levkocitov z uporabo elektronskih naprav. Štetje levkocitov v števcih delcev poteka po enakem principu kot eritrociti. Predkrovina se razredči in zmeša z vsemi reagenti, ki lizirajo rdeče krvne celice. V samodejnem analizatorju „Technicon“ se kot taka uporablja raztopina ocetne kisline v napravah „Culter“ in „Celloskop“ - saponin ali sapoglobin, ki se dodata razredčeni (1: 500, 1: 700) v izotonični raztopini natrijevega klorida (6 kapljic na 20 ml). vzrejo).
Število krvnih levkocitov se izvaja pri obarvanih razmazih periferne krvi.
Bolje je šteti na najtanjšem mestu blizu konca brisa, vsaj 200 celic (razen izrazite levkopenije) in nato izračunati odstotno razmerje nekaterih vrst belih krvnih celic. Štetje se priporoča v enakem vrstnem redu: polovico celic je treba šteti na vrhu, polovico na dnu kapi, ne da bi šli do samega roba in sredine, cik-cak (3-4 vidna polja ob potezi, 3-4 polja pod pravim kotom do sredine udarca, nato 3-4 polja na stran, vzporedno z robom, spet pod pravim kotom navzgor in tako naprej na eno stran).
Priprava brisov. Previdno oprano in razmaščeno steklo (njegov rob) se dotakne kapljice krvi na mestu injiciranja. Razmažite brusilno steklo in ga postavite pod kotom 45 ° proti drsniku pred padcem. Ko je steklo pripeljalo do te kapljice, počakajo, da se kri širi vzdolž njenega roba, nato pa s hitrim in enostavnim gibanjem izvedejo brusilno steklo naprej, ne da bi ga vzeli stran, preden izsuši celotno kapljico.
Pravilno izdelan madež je rumenkaste barve (tanek), ne doseže robov stekla in se konča v sledu (brki).
Obarvanje suhih brisov po predhodni fiksaciji. Najboljša fiksacija je dosežena v absolutnem metilenskem alkoholu (3-5 minut) ali v mešanici Nikiforovih enakih delov absolutnega etanola in etra (30 minut).
Glavne hematološke barve so metilen modra in njen derivat - azurno (metilen azurno) in azurno modro (mešanica enakih delov azurnega I in metilensko modro), do kislega - vodotopnega rumenega eozina.
● Slikarstvo Romanovskega-Giemsa. Romanovsky-Giemsa barva (tovarniško izdelana) ima naslednjo sestavo: Azur II - 3 g, vodotopni rumeni eozin - 0,8 g, metilni alkohol - 250 ml in glicerin - 250 ml. Delovna barvna raztopina se pripravi v količini 1,5-2 kapljice končne barve na 1 ml destilirane vode. Barvo se nalije na razmaz z možno višjo plastjo; čas barvanja - 30-35 minut Po tem obdobju se brisi sperejo z vodo in posušijo na zraku. Pri tej metodi je mogoče dobro razlikovati jedro, vendar je nevtrofilna zrnavost citoplazme veliko slabša, zato se pogosto uporablja za obarvanje razmaza periferne krvi.
● Kombinirana barvila May-Grunwald-Romanovsky-Giemsa po Pappenheimu. Končno barvilo, May-Grunwaldov fiksir, ki je raztopina eozinmetilen modrega v metilenskem alkoholu, 3 minute pipetiramo na fiksni razmaz. Po 3 minutah k barvi, ki pokriva raztopino, dodamo enako količino destilirane vode in barvo nadaljujemo še 1 minuto. Po tem se barva izpere in bris posuši na zraku. Potem se posušen razmaz prebarva s sveže pripravljeno vodno raztopino Romanovsky barve za 8-15 minut. Ta metoda se šteje za najboljšo, zlasti za madeže kostnega mozga.
Povečanje števila levkocitov v periferni krvi nad normalno raven se imenuje levkocitoza, zmanjšanje pa se imenuje levkopenija. Za levkocitozo (levkopenija) je redko značilno sorazmerno povečanje (zmanjšanje) števila vseh vrst levkocitov, na primer levkocitoza z zgostitvijo krvi. V večini primerov se poveča število (zmanjšanje) katerega koli tipa celice. Povečanje ali zmanjšanje števila posameznih vrst levkocitov v krvi je lahko relativno ali absolutno, odvisno od skupnega števila levkocitov - normalno, povišano ali zmanjšano. Sprememba števila, razmerja med posameznimi oblikami in morfologijo levkocitov je odvisna od vrste in virulence patogena, narave, poteka in obsega patološkega procesa, individualne reakcije organizma.
Levkociti (levkociti)
Levkociti. Kvantitativna določitev levkocitov. Štetje levkocitov z uporabo kamere Goryaeva. Kvantitativna vsebnost levkocitov. Levkocitoza.
Bele krvne celice
Število levkocitov v krvi je odvisno tako od hitrosti njihovega nastajanja kot od njihove mobilizacije iz kostnega mozga, pa tudi od njihove uporabe in migracije v tkiva (v lezije), zajema pljuča in vranice. Na te procese vplivajo številni fiziološki dejavniki, zato je število levkocitov v krvi zdravega človeka odvisno od nihanj: do konca dneva, med fizičnim naporom, čustvenim stresom, vnosom beljakovinskih živil in nenadnimi spremembami temperature okolja.
Kvantitativna določitev levkocitov
Levkocite preštejemo z Goryaevovo kamero in z uporabo samodejnih števcev.
Štetje levkocitov z uporabo kamere Goryaeva
Z in vitro metodo odvzema krvi za štetje levkocitov:
- V epruveto se vlije 0,4 ml raztopine 3-5% ocetne kisline, obarvane z metilensko modro. S kapilarno pipeto potegnite 20 μl krvi iz sveže kapljice (20-kratno razredčenje), previdno jo odnesite v epruveto z reagentom in pipeto sperite. Dobro premešamo;
- čisto in suho pokrivno steklo se vtisne v komoro, tako da se na točki dotika oblikujejo mavrični obroči;
- raztopimo v epruveti, dobro premešamo. Konec okrogle steklene palice vzame kapljico krvi in jo pripelje na rob poliranega stekla komore;
- po polnjenju komore se pusti 1 minuto mirovanja za sedimentacijo levkocitov;
- Upoštevajo se levkociti pri majhni povečavi (objektiv × 8 ali × 9, okular × 10 ali × 15) s temnim vidnim poljem (s spuščenim kondenzatorjem ali zoženo membrano);
- za zadovoljive rezultate se levkociti preštejejo v 100 velikih kvadratov.
Poznavanje prostornine velikega kvadrata in stopnje razredčitve krvi, našli število levkocitov v 1 μl in 1 l krvi. Stranica velikega kvadrata je 1/5 mm, površina je 1/25 mm2, prostornina prostora nad tem kvadratom pa je 1/250 mm3.
Formula za štetje belih krvnih celic:
kjer je B število levkocitov v 100 velikih kvadratih;
P - stopnja razredčitve (20).
Število levkocitov
Norm: 4,0–9,0 × 10 9 / L
Poveča se število levkocitov nad 9,0 × 10 9 / l
levkocitoza, zmanjšanje njihovega števila pod 4,0 × 10 9 / l - levkopenija. Vendar je lahko norma tudi 3,5 × 10 9 v 1 l levkocitov za številne posameznike. Glede na literaturo imajo takšni ljudje večjo imunsko odpornost in je manj verjetno, da bi se razboleli, kar je verjetno posledica potrebe po imunskem odzivu, da imajo rezerve levkocitov v tkivih, kjer je 50–60-krat več kot v krvnem obtoku. Očitno je, da se pri zdravih osebah z nizkim številom belih krvnih celic v periferni krvi njihove zaloge v tkivih ustrezno povečajo. Ta pojav je pojasnjen z dednim in družinskim značajem ali s povečanjem vpliva parasimpatičnega živčnega sistema.
Leukopenija je lahko funkcionalna in organska.
Funkcionalna levkopenija je povezana z disregulacijo tvorbe krvi in je opažena:
- z nekaterimi bakterijskimi in virusnimi okužbami (tifus, gripa, črne koze, rdečke, Botkinova bolezen, ošpice);
- pod delovanjem zdravil (sulfonamidi, analgetiki, antikonvulzivi, antitiroidi, citostatiki in druga zdravila);
- pri mišičnem delu, vnos tujih beljakovin, živčnih in temperaturnih učinkov, stradanje, hipotonično stanje;
- pri dolgotrajnem shranjevanju krvi pri sobni temperaturi (več kot 4 ure) lahko pride do povezovanja lažne levkocitopenije z agregacijo levkocitov.
Organska levkopenija, ki je posledica aplazije kostnega mozga in njene zamenjave z maščobnim tkivom, se pojavi, ko: t
- aplastična anemija;
- agranulocitoza;
- levkopenična levkemija;
- nekatere oblike Hodgkinove bolezni;
- ionizirajoče sevanje;
- hipersplenizem (primarni in sekundarni);
- bolezni kolagena.
Levkocitoza
Levkocitoza je reakcija hematopoetskega sistema na učinke
eksogeni in endogeni dejavniki. Obstajajo fiziološke in patološke levkocitoze.
Fiziološka levkocitoza je:
- prebavni - po jedi, še posebej visoko vsebnost beljakovin; število levkocitov ne presega 10,0–12,0 × 10 9 / l in se po 3-4 urah vrne v normalno stanje;
- s čustvenim stresom (adrenalin), hudim fizičnim naporom, ohlajanjem, prekomernim izpostavljenostjo soncu (sončnim opeklinam), dajanjem številnih hormonov (kateholamini, glukokortikosteroidi itd.), v drugi polovici nosečnosti, med menstruacijo in zaradi neenakomerne porazdelitve levkocitov v krvi mainstream.
Patološka levkocitoza je razdeljena na absolutno in relativno.
Absolutna levkocitoza - povečanje števila levkocitov v krvi do več sto tisoč (100,0–600,0 × 10 9 / l in več).
- Najpogosteje opaziti pri levkemiji: pri kronični levkemiji - v 98-100% primerov, pri akutni levkemiji - v 50-60%. Spreminjanje razmerja levkocitnih celic v kostnem mozgu in krvni punktaciji služi kot osnova za diagnozo levkemije.
Opazujemo relativno levkocitozo:
- akutni vnetni in infekcijski procesi, razen tifusne, gripe, črnih koz, rdečk, Botkinove bolezni, ošpic. Največjo levkocitozo (do 70,0–80,0 × 10 9 / l) opazimo pri sepsi;
- pod vplivom strupenih snovi (strupi insektov, endotoksini), ionizirajoče sevanje (takoj po obsevanju);
- zaradi delovanja kortikosteroidov, adrenalina, histamina, acetilholina in preparatov digitalisa;
- z razpadanjem tkiva (nekroza), miokardnim infarktom, trombozo perifernih arterij z razvojem gangrene, opeklin, eksudativnim plevritisom, perikarditisom, uremijo, jetrno komo;
- pomembna izguba krvi pri poškodbah, notranje, ginekološke in druge krvavitve.
Povečanje števila levkocitov pri nalezljivih boleznih v večini primerov spremlja premik levkocitne formule v levo
Štetje števila levkocitov in krvnih ploščic
Dejavniki, ki vplivajo na pravilnost študije belih krvnih celic
- dolgotrajno shranjevanje krvi pri sobni temperaturi
Norme vsebnosti levkocitov v krvi
Starost Število levkocitov
- 1 dan 11,6 - 22,0
- 1 teden 8.1.- 14.3
- 1 mesec 7,6 - 12,4
- Odrasli 4.0 - 9.0
Metode za določanje števila levkocitov v krvi.
- Štetje števila levkocitov v komori za štetje
- Štetje levkocitov v hematoloških analizatorjih
Določanje števila levkocitov v komori za štetje.
- Štetje levkocitov pod mikroskopom se izvede po liziranju rdečih krvnih celic v 100 velikih kvadratih mreže za štetje in ponovno izračuna za 1 liter krvi, glede na volumen kvadratov in razredčitev krvi. Število levkocitov je treba vzeti v 2-4 urah po odvzemu krvi.
- Če so v periferni krvi prisotne rdeče krvne celice, se ne lizirajo in preštejejo skupaj z levkociti. V tem primeru se za določitev pravega števila levkocitov odšteje število celic v rdeči vrstici od skupnega števila preštetih celic.
- Na primer: Skupno število levkocitov v izračunu v komori (ali analizatorju) -45x109 / l. Pri izračunu levkocitne formule je bilo ugotovljeno, da je prisotnih 50 eritroblastov (normoblastov) na 100 levkocitov.
Izračunamo pravo število levkocitov v krvi:
150 celic - 45 x 109 / l
100 celic (levkociti) - X
X = 100x45x10 / l / 150 = 30x10 / l
Tako je dejansko število levkocitov v krvi 30 x 109 / l.
Glavni viri napak pri izračunu levkocitov v komori:
- Nepravilen delež volumnov krvi in ocetne kisline, vzetih v epruveti.
- Nepravilno pripravljena raztopina ocetne kisline (pri koncentraciji več kot 5%, lahko nekateri levkociti, kar bo pripeljalo do podcenjevanja rezultata).
- Dolgotrajna izpostavljenost vzorca pri temperaturah nad 28 ° C, ki lahko pospeši lizo levkocitov v vzorcu in povzroči podcenjevanje rezultata.
- Nepravilno polnjenje komore Goryaev. Kot pri izračunu rdečih krvnih celic, je treba fotoaparat pustiti 1 minuto, da se celice usedejo.
- Kamera Goryaev po predhodni definiciji ni bila dovolj dobro oprana. Leukociti, ki ostanejo v komori, lahko precenjujejo rezultate analize.
Metode štetja trombocitov
- v komori za štetje
Vsaka skupina metod ima prednosti in slabosti.
- Štetje trombocitov v komori je dovolj natančno, ne zahteva izračuna števila rdečih krvnih celic. Po drugi strani pa je ta metoda bolj zahtevna, saj so trombociti v naravni obliki predstavljeni z majhnimi in slabo kontrastnimi elementi. Pomanjkljivost metode je štetje trombocitov v naslednjih urah po jemanju krvi.
- Določanje števila trombocitov v krvnih razmazih je po svoji natančnosti bistveno slabše od komorne metode ali avtomatskih števcev. Napake pri štetju krvnih madežev so lahko posledica slabe kakovosti brisa in s tem povezane neenakomerne porazdelitve trombocitov, netočne določitve števila rdečih krvnih celic. Pomembna pomanjkljivost metode je potreba po hkratnem štetju trombocitov in rdečih krvnih celic v krvi. Prednost tega je sposobnost študija trombocitov v vsakem trenutku, ne glede na čas odvzema krvi.
- Metoda določanja trombocitov z uporabo hematološkega analizatorja vam omogoča natančno določanje števila trombocitov, njihovega povprečnega volumna in porazdelitve po prostornini.
Število levkocitov
Število levkocitov se izračuna z uporabo avtomatskega števca ali v Goryavovi komori. Za štetje levkocitov v komori pripravimo turško tekočino - raztopino ocetne kisline, obarvano z vodno raztopino metilen modrega (0,1 ml 0,1% raztopine metilen modrega dodamo k 9 ml 10% ocetne kisline). V epruveto vlijemo 0,4 ml tekočega Türka. Pridobite natančno 0,02 ml krvi, previdno dodajte v redčilno tekočino. Razredčevanje krvi je 1:20. Dobro premešamo in pustimo stati 4 minute. Izpolnite komoro Goryaeva, po skrbnem stresanju cevi z razredčeno kri. Kamera pustimo 1 minuto na ploski površini za sedimentacijo levkocitov. Nato se levkociti preštejejo pri majhni povečavi mikroskopa (leča 8, okular 10 ali 15) s temnim vidnim poljem (s spuščenim kondenzatorjem ali zoženo membrano). Za levkocite se šteje, da so v 100 nerazkritih velikih kvadratih, kar ustreza 1600 majhnim. Rezultati štetja celic v velikih kvadratih povzamejo in izračunajo njihovo število v 1 μl krvi po formuli:
kjer je X število levkocitov v 1 μl krvi; A - število celic v 100 velikih kvadratih, 1600 - število majhnih kvadratov; 20 - redčenje krvi; 4000 je množitelj, ki povzroči volumen 1 μl krvi, glede na volumen majhnega kvadrata (1/4000 μl).
Štetje levkocitne formule Preučujemo obarvane madeže periferne krvi. Nujni pogoj za pravilno upoštevanje morfoloških značilnosti krvnih celic je pravilno pripravljen in dobro obarvan krvni razmaz. Na suhih, čistih, dobro razmaščenih stekelcih, pripravljenih v mešanici Nikiforov (etilni alkohol 96 ° in dietil eter 1: 1), se pripravi razmaz krvi. Ob daljših robovih stekelca se dotaknite njegove površine do kapljice krvi (ne pa tudi kože), ki se sprošča iz vboda, ali nanesite kapljico krvi z mikropipeto ali kapilaro. Na mizo ali v levo roko držite stekleno stekelce za ozke robove. Z desno roko nanesite mleto steklo z ozkim robom na steklo s krvjo na levo od padca pod kotom 45 ° in ga potisnite v desno, dokler se ne dotakne krvi. Čakajo, da se kri razlije po celotnem robu stekla, nato pa ga s hitrim, hitrim gibanjem pripelje od desne proti levi, dokler ni izčrpana celotna kapljica. Kapljica krvi mora biti majhna in sorazmerna, tako da se celoten bris položi na steklo, ne da bi dosegel 1-1,5 cm pred njegovim robom. Dobro izdelan bris je tanek, rumenkaste barve in se konča v "metli". Na zraku posušene razmazane krvi damo v posebne posode za fiksacijo ali v navadna steklena stekla, napolnjena s fiksirno tekočino (metilni alkohol, čas fiksacije 3-5 minut; etilni alkohol, 30 minut; Nikiforova mešanica, 20-30 minut). Fiksni preparati se posušijo na zraku in nato obarvajo z barvilom Romanovsky-Giemsa. Končna barvna raztopina Romanovsky-Giemsa (azureozin) razredčena 1:10 v zahtevanem volumnu za barvanje. Fiksne madeže se polijejo z razredčeno barvo, ki se zlije na razmaz z možno višjo plastjo. Barvanje traja od 25 do 45 minut, odvisno od temperature zraka v prostoru. Po barvanju izperite barvo z destilirano vodo in potegnite navpično udarce v leseno stojalo, da se posuši. Mikroskopijo krvnih madežev opravimo s potopitvijo s povečavo 100 × 10. Štetje levkocitov poteka vzdolž cik-cak črte ("meandrična črta"), prešteje se 100-200 celic ob upoštevanju števila posameznih oblik levkocitov: stab in segmentiranih nevtrofilcev, eozinofilcev, bazofilcev, monocitov, limfocitov. Izračunajte odstotek vsake vrste celice.
Štetje absolutnega števila fagocitov in limfocitov Absolutno število fagocitov (nevtrofilcev in monocitov) in limfocitov višjih vretenčarjev se izračuna na podlagi podatkov o številu levkocitov v periferni krvi in levkocitni formuli.
Test fagocitne funkcije
Določanje fagocitnega indeksa in fagocitnega števila
Za oceno absorpcijske in prebavne aktivnosti levkocitov je bilo razvitih veliko tehnik. Vsi ti temeljijo na sposobnosti fagocitov, da absorbirajo tuje delce, ki sestavljajo testni sistem (posebna vrsta mikroorganizmov, zimosan, lateks - predmet absorpcije). Razkritje se opravi in vitro ali in vivo. Splošni potek določanja: Heparinizirana ali citrirana sveža kri (ali suspenzija fagocitov) se zmeša z enako količino suspendirane dnevne mikrobne suspenzije (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E.coli, A. nydrophila) ali drugega absorpcijskega objekta. Mešanica se nežno zmeša in postavi v termostat (37-40ºС - za toplokrvno glede na normalno temperaturo telesa, 26 ° C - za toplotno ljubeče ribe in nižje za hladno ljubezen). Po 15, 30, 45, 60 in 90 minutah se preparati pripravijo na stekelcih, posušijo, fiksirajo z metilnim alkoholom ali Nikifovovo mešanico in obarvajo po Romanovsky-Giemsi. Oglejte si razmaze pod potopitvijo in določite fagocitno aktivnost - odstotek fagocitov, ki sodelujejo v fagocitozi, fagocitni indeks - število testnih mikroorganizmov, ki jih zajema en fagocitni levkocit, fagocitno število - povprečno število fagocitnih objektov na 1 aktivni nevtrofil. Vrednotenje kazalnikov v različnih časovnih intervalih nam omogoča oceno dinamike fagocitoze. Običajno naj bi bil po 90 minutah fagocitni indeks nižji kot po 45 minutah in 60 minutah, zaradi prebave mikrobov. V primeru kršitve prebave se ne spremeni.
Ocena funkcionalne aktivnosti fagocitov z redukcijsko reakcijo nitro-modrega tetrazola (NBT-test)
Ta test je pokazatelj baktericidne funkcije fagocitov in vam omogoča, da ocenite njihovo sposobnost ubijanja, odvisnega od kisika. Ko je ta mehanizem za ubijanje aktiviran, se aktivira encim NADPH oksidaza, ki vodi v pojav reaktivnih kisikovih vrst v fagocitih. Sproščanje takšnih snovi v celici se imenuje kisikova (dihalna) eksplozija, ki se lahko registrira z uporabo NBT testa. Pri oblikovanju tega testa se fagocitam doda snov nitrosinijev tetrazolij, ki jo celica absorbira in v prisotnosti reaktivnih kisikovih oblik postane modro obarvana snov, diformazan. Bolj temno modra zrnca so pritrjena na površini ali v notranjosti fagocitov, bolj se tvorijo aktivne kisikove oblike, bolj ubijanje, odvisno od kisika.
Test NBT je nastavljen v dveh različicah: spontan in induciran. Pri vzpostavitvi spontanega NBT-testa se fagociti gojijo v prisotnosti NST brez predhodne aktivacije celic, pri izvajanju induciranega NBT-testa pa se v gojišče doda aktivator fagocitne reakcije. Nastavitev NBT testa v dveh variantah omogoča izračun funkcionalne rezerve celic, ki je razlika med številom (intenzivnostjo) induciranih diformazan-pozitivnih celic in številom (intenzivnostjo) spontanih diformazan-pozitivnih celic. Vrednosti induciranega NBT testa označujejo aktivnost fagocitnih celic v prisotnosti antigenskega dražljaja in veljajo za merilo njihove pripravljenosti za popolno fagocitozo. Spontani NBT-test omogoča oceno stopnje aktivacije mehanizmov ubijanja, ki so odvisni od kisika neaktiviranih fagocitov. Značilna je stopnja aktivacije znotrajceličnih mikrobicidnih sistemov.
Za tvorbo spontanega NBT testa se 0,1 ml 0,2% raztopine NBT v kalijevem fosfatnem pufru (0,1, pH 7,3) in 0,05 ml istega pufra doda 0,1 ml krvi. Vzporedno se vzame vzorec za induciran NBT preskus, pri katerem se namesto 0,05 ml pufra doda enak volumen fagocitnega aktivatorja (npr. Pirogenal pri koncentraciji 50 μg / ml). Reakcijsko zmes termostiramo v vodni kopeli pri 37 ° C (30–60 min). Pripravimo razmaze srednje gostote, posušimo na zraku in fiksiramo v etilni alkohol ali mešanico Nikiforov (20 min), nato pobarvamo z vodno raztopino nevtralne rdeče (0,1%, 1 min).
Po reakciji se krvni razmaz mikroskopira pod potopitvijo (100 × objektiv, 10 × okular). Med 100 celicami se šteje delež aktiviranih nevtrofilcev (DAN,%), ki vsebujejo diformazanske granule. Glede na količino dipherformazana, odloženega v celicah, je njihova aktivnost ovrednotena v poljubnih enotah in izračunan je indeks aktivacije nevtrofilcev (IAN, uporabljene enote):
kjer je HNeg. - število celic, ki ne vsebujejo diformazanskih granul;
H1 - število celic, v katerih je območje usedlin diformazana manjše od 1/3 površine jedra;
H2 - število celic, v katerih se depoziti diformazana gibljejo od 1/3 do celotne velikosti jedra;
H3 - število celic, v katerih diformazanske usedline zavzemajo večje območje jedra.
Izvedba koeficienta mobilizacije (KM), izvedena po naslednji formuli: